李紫瓊，木尼拉，高　峰

反義I型轉(zhuǎn)化生長因子β受體和反義TIMP-1聯(lián)合作用對(duì)大鼠肝纖維化的抑制作用

李紫瓊，木尼拉，高峰

【摘要】目的觀察轉(zhuǎn)化生長因子βI型受體（TβRI）反義RNA聯(lián)合TIMP-1反義RNA對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的影響。方法構(gòu)建TβRI和TIMP-1反義RNA真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，共同導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠體內(nèi)；應(yīng)用免疫印記技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織TIMP-1、TβRI和MMP-13蛋白表達(dá)水平。結(jié)果正常對(duì)照組、反義TβRI組、反義TIMP-1組、聯(lián)合治療組、空質(zhì)粒組和模型組動(dòng)物肝組織TIMP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（23.6±2.8）、（57.96±3.8）、（62.3±2.8）、（34.2±2.8）、（279.2±29.8）和（287.3±23.7），TβRI蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為（56.2±2.7）、（70.5.±1.8）、（77.0±1.7）、（60.6±2.2）、（232.0±19.4）和（241.0±18.3），MMP-13蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（17.84±2.3）、（36.2±3.7）、（41.3±2.4）、（28.6±2.0），（127.3±1.2）和（118.5±2.5），與正常對(duì)照組及空質(zhì)粒組比，反義TβRI組、聯(lián)合治療組和反義TIMP-1組TβRI、TIMP-1和MMP-13蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05），但空質(zhì)粒組與模型組比無顯著性差異。結(jié)論TβRI和TIMP-1反義RNA能有效抑制TβRI、TIMP-1和MMP-13蛋白表達(dá)，兩者聯(lián)合應(yīng)用可產(chǎn)生疊加效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】肝纖維化；反義RNA；質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化生長因子β；基質(zhì)蛋白酶組織抑制因子

肝纖維化的形成主要是由于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解減少，導(dǎo)致ECM沉積增多所致。在肝纖維化形成過程中，一般認(rèn)為存在轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路，首先活化的TGF-β與II型TGF-β受體（TβRII）結(jié)合，并使之磷酸化而具有激酶活性；與TGF-β結(jié)合的TβRII再結(jié)合I型TGF-β受體（TβRI），形成I型和II型受體復(fù)合物，并使TβRI磷酸化，具有激酶活性；最后，激活的TβRI激活酶磷酸化其特殊的受體Smads（R-Smads），從而調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞（HSC）的轉(zhuǎn)化和ECM的合成與降解。TβRI是唯一的直接將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)的受體。ECM的降解受基質(zhì)金屬蛋白酶-基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（MMPs-TIMPs）系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，其中間質(zhì)膠原酶（人MMP-1和鼠MMP-13）在降解纖維化肝臟ECM過程中起重要作用。本研究通過基因重組及反義技術(shù)，構(gòu)建了反義TβRI和反義TIMP-1真核表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入到實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠體內(nèi)，觀察它們對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝組織TβRI、TIMP-1和MMP-13蛋白表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑正常純種系雌性SD大鼠（新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），Trizol Reagent、質(zhì)粒抽提試劑盒為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。QIAGEN一步法RT-PCR試劑盒為德國QIAGEN公司產(chǎn)品。BCA蛋白定量試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Xholl、EcoRI為美國Promega公司產(chǎn)品。JM-109大腸桿菌菌株（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)）?？筎βRI單克隆抗體、抗 MMP-13單克隆抗體、抗TIMP-1單克隆抗體、抗β-actin均為美國R&D公司產(chǎn)品。堿性磷酸酶標(biāo)記的鼠抗IgG等為碧云天生物科學(xué)技術(shù)研究所產(chǎn)品。

1.2反義 TβRI和反義TIMP-1質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定根據(jù)TβRI和TIMP-1 cDNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物，由上海Sangon生物公司合成：取正常大鼠肝組織50 mg，提取總RNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，行RT-PCR獲得TβRI和TIMP-1cDNA基因片段，經(jīng)PCR擴(kuò)增、純化和回收。對(duì)基因片段應(yīng)用雙切酶進(jìn)行兩次雙酶切、線性化、純化后回收。應(yīng)用T4 DNA連接酶分別將線形化的質(zhì)粒與TβRI和TIMP-1基因片段定向及反向連接，構(gòu)建以pcDNA31（+）為載體的反義TβRI和反義TIMP-1真核表達(dá)質(zhì)粒。取陽性克隆，送上海生物工程公司測(cè)序分析，證實(shí)以pcDNA3.1（+）為載體的反義TβRI和反義TIMP-1真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.3實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠模型制備及質(zhì)粒的導(dǎo)入取雌性SD大鼠90只，體質(zhì)量160～200 g。將大鼠隨機(jī)分為6組：即反義TβRI治療組、反義TβRI+反義TIMP-1治療組、反義TIMP-1治療組、pcDNA3.1（+）空質(zhì)粒對(duì)照組、模型組和正常對(duì)照組，每組15只。采用尾靜脈注射CCl4、高脂食物混合喂養(yǎng)，其中肝纖維化大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中死亡1只。通過病理組織學(xué)觀察，制備大鼠肝纖維化模型成功。各實(shí)驗(yàn)組大鼠體內(nèi)分別導(dǎo)入相應(yīng)的質(zhì)粒治療，正常對(duì)照大鼠同時(shí)給予生理鹽水500 mL腹腔注射。所用質(zhì)粒在注射前按比例與Lipofectmine2000混勻，經(jīng)腹腔定期注射至實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔內(nèi)，至第8周末處死動(dòng)物，取實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織50 mg進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，對(duì)部分大鼠肝組織行病理學(xué)檢查。

1.4肝組織TIMP-1、TβRI和MMP-13蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用Western bloting法。取大鼠肝組織50 mg，按照蛋白提取試劑盒說明書操作，提取總蛋白。應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒定量。加入蛋白質(zhì)60 μg，使用10%聚丙烯酰胺凝膠在電泳儀上電泳，分離蛋白。將分離后的蛋白通過電轉(zhuǎn)膜儀，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。分別用封閉液封閉PVDF膜，分別加抗TIMP-1單克隆抗體、抗TβRI單克隆抗體、抗MMP-13單克隆抗體和抗β-actin孵育，再加二抗孵育。應(yīng)用發(fā)光試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)移在PVDF膜上的蛋白進(jìn)行曝光，洗片，照相，應(yīng)用Quantity one凝膠成像分析，對(duì)膠片進(jìn)行照相，計(jì)算每個(gè)條帶的光密度值，用 TIMP-1/β-actin、TβRI/β-actin、MMP-13/β-actin光密度比值表示TIMP-1、TβRI和MMP-13蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以（x±s）表示，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠肝組織TIMP-1、TβRI和MMP-13蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較見表1和圖1～3。結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒組和模型組相比，反義TIMP治療組TβRI蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），反義TIMP-1治療組肝組織TIMP-1和MMP-13蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與空質(zhì)粒組和模型組比，反義TβRI+反義TIMP治療組肝組織TβRI、TIMP-1和MMP-13蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；肝纖維化模型組與空質(zhì)粒組比，三

表1　各組大鼠肝組織TIMP-1、TβRI和MMP-13蛋白表達(dá)水平（x±s）

種蛋白表達(dá)的差異無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1　各組大鼠肝組織MMP-13蛋白的表達(dá)

A：空質(zhì)粒；B：肝纖維化；C：反義TβRI治療；D：反義TIMP-1治療；E：反義TβRI+反義TIMP-1治療；N：正常對(duì)照組

圖2　各組大鼠肝組織TβRI蛋白的表達(dá)

A：空質(zhì)粒；B：肝纖維化；C：反義TβRI治療；D：反義TIMP-1治療；E：反義TβRI+反義TIMP-1治療；N：正常對(duì)照組

圖3　各組大鼠肝組織TIMP-1蛋白的表達(dá)

A：空質(zhì)粒；B：肝纖維化；C：反義TβRI治療；D：反義TIMP-1治療；E：反義TβRI+反義TIMP-1治療；N：正常對(duì)照組

3　討論

肝纖維化的主要病理生理特征是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的生成和降解的失衡，調(diào)節(jié)這一平衡的主要系統(tǒng)是基質(zhì)金屬蛋白酶-基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子系統(tǒng)及TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路。在肝纖維化形成過程中，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞都會(huì)分泌釋放大量的TGF-β，可明顯激活HSC轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，大量合成ECM，對(duì)肝纖維化的發(fā)生，發(fā)展起著重要作用［1～6］。目前，人們公認(rèn)在肝組織受到損傷因子的作用后，TGF-β的大量活化和釋放是機(jī)體損傷修復(fù)的重要過程［7］。在正常情況下，TGF-β的這一生物學(xué)功能對(duì)機(jī)體具有積極的意義，當(dāng)TGF-β超過正常表達(dá)時(shí)，它可以使組織修復(fù)過程變成慢性過程，最終導(dǎo)致組織器官發(fā)生纖維化、硬化、結(jié)構(gòu)破壞、功能喪失。如果選擇性地調(diào)節(jié)和阻斷TGF-β的功能，對(duì)肝纖維化逆轉(zhuǎn)有著積極的意義。

在肝纖維化形成過程中，MMP-13活性受到其特異性抑制劑TIMP-1的調(diào)節(jié)。關(guān)于MMP-13在整個(gè)肝纖維化發(fā)生過程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，國內(nèi)外的研究結(jié)論不一。聶青和等人研究發(fā)現(xiàn)TIMP-1可以與MMP-1 和MMP-3結(jié)合，并抑制其活性，TIMP-1表達(dá)增強(qiáng)可促進(jìn)纖維化的肝臟間質(zhì)膠原的沉積，且肝纖維化的程度變得嚴(yán)重，因而認(rèn)為它是肝纖維化發(fā)生過程中一個(gè)非常重要的促發(fā)因素［8］。國外Kossakowska et al［9］認(rèn)為在大鼠肝纖維化形成過程中TIMP-1表達(dá)持續(xù)增高，但MMP-13表達(dá)水平幾乎保持不變。Okazaki et al［10］認(rèn)為，MMP-13表達(dá)在大鼠肝纖維化發(fā)生過程中有一短時(shí)輕度增高的過程，然后在肝纖維化逆轉(zhuǎn)的早期也有一短時(shí)明顯增高過程，在其它時(shí)段沒有什么變化。朱躍科等［11］研究了肝纖維化過程中基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及相互關(guān)系顯示，在大鼠肝組織受到二甲基亞硝胺損傷后數(shù)天，TIMP-1即先于MMP-13表達(dá)增高，表明在肝纖維化發(fā)生初期，膠原的降解即受到抑制，有利于膠原的沉積；在肝纖維化的發(fā)展階段，雖然MMP-13的表達(dá)明顯增高，但由于TIMP-1也處于明顯增高的水平，這個(gè)階段MMP-13活性依然相對(duì)受到抑制，沉積的膠原得不到有效降解；在實(shí)驗(yàn)后期，即進(jìn)入肝纖維化晚期或早期肝硬化階段，MMP-13表達(dá)明顯降低，而TIMP-I表達(dá)仍持續(xù)增高，MMP-13降解膠原的能力絕對(duì)受到抑制，加上膠原的表達(dá)與沉積不斷增多，最終促成肝纖維化乃至肝硬化的形成。

本研究應(yīng)用CCL4混合法成功制備大鼠肝纖維化模型。成功構(gòu)建反義TβRI及反義TIMP-1真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠體內(nèi)，反義TβRI及反義TIMP-1真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒能在大鼠體內(nèi)有效表達(dá)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝纖維化大鼠在導(dǎo)入反義TβRI及反義 TIMP-1真核表達(dá)質(zhì)粒后，發(fā)現(xiàn)TIMP-1、TβRI、MMP-13蛋白表達(dá)量明顯下降，故可認(rèn)為兩種反義質(zhì)粒有效地抑制了相應(yīng)蛋白的表達(dá)，證實(shí)質(zhì)粒導(dǎo)入成功，作用可靠。當(dāng)兩種反義質(zhì)粒同時(shí)使用時(shí)可使TβRI蛋白、TIMP-1蛋白、MMP-13蛋白表達(dá)量顯著降低，可能與TGF-β和TIMP-1兩種細(xì)胞因子之間存在相互影響有關(guān)。

楊長青等［12］在免疫誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠體內(nèi)導(dǎo)入通過基因重組技術(shù)構(gòu)建的大鼠MMP-1和反義TIMP-1真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，試圖通過單純阻斷某一個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路來阻斷肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝纖維化程度在一定程度上得到了逆轉(zhuǎn)。Knittel T et al［13］研究發(fā)現(xiàn)在四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠，在肝纖維化明顯時(shí)僅能檢測(cè)到低水平的MMP-13 mRNA，在肝纖維化恢復(fù)期MMP-13 mRNA水平又顯著增加。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果不完全一致，可能原因是致肝纖維化模型的原因及恢復(fù)時(shí)的外因不同，而測(cè)定MMP-13表達(dá)的時(shí)期不同也是另外一個(gè)可能的原因［14］。

我們研究結(jié)果表明，反義TβRI及反義TIMP-1真核表達(dá)質(zhì)粒能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化。兩者聯(lián)合作用可產(chǎn)生疊加效應(yīng)。反義TIMP-1真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒能夠在分子水平封閉肝臟內(nèi)源性TIMP-1表達(dá)，從而促進(jìn)間質(zhì)膠原酶MMP-13活性，在一定程度上使實(shí)驗(yàn)性肝纖維化得以逆轉(zhuǎn)［15，16］。反義TβRI能在一定程度上經(jīng)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路阻斷實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的發(fā)展［17］。國內(nèi)有一些應(yīng)用中藥逆轉(zhuǎn)肝纖維化的報(bào)道，但具體機(jī)制不清［18～20］。本研究從分子水平研究，發(fā)現(xiàn)反義TβRI及反義TIMP-1真核表達(dá)質(zhì)?？稍谝欢ǔ潭饶孓D(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化，為臨床抗肝纖維化的基因治療奠定了基礎(chǔ)。

肝纖維化是一個(gè)復(fù)雜的多因素作用過程，各種細(xì)胞因子間的相互協(xié)調(diào)以及細(xì)胞因子與其他因素間的相互作用形成了復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，并共同影響相應(yīng)的靶細(xì)胞。在正常狀態(tài)下，肝臟細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)處于一種平衡狀態(tài)，在各種損傷因素的作用下，這些因子一旦失衡，正向調(diào)解肝纖維化的細(xì)胞因子就會(huì)產(chǎn)生瀑布效應(yīng)，導(dǎo)致ECM的過度沉積而形成肝纖維化［1］。因此，在肝纖維化的防治過程中，單用一種細(xì)胞因子或用一種細(xì)胞因子抗體或其受體拮抗劑均不能有效地阻止疾病的發(fā)展過程，而對(duì)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的整體調(diào)整使其構(gòu)成和所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)趨于正常化或同時(shí)采用消除病因等綜合措施，才有可能取得較好的治療效果。

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（收稿：2014-05-16）（本文編輯：陳從新）

第一作者：李紫瓊，男，37歲，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師。主要從事肝纖維化研究。E-mail：liazi2006@126.com

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.01.017

作者單位：830000烏魯木齊市新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科

Inhibiting effects of antisense transforming growth factor β type I receptor and antisense TIMP-1 on experimental hepatic fibrosis in ratsLi Ziqiong，Mu Nila，Gao Feng.Department of Gastroenterology，People's Hospital，Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumchi 830000，Xin Jiang Uygur Autonomous Region，China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of transforming growth factor β type I receptor（TβRI）antisense RNA and tissue inhibitor of metalloproteinase 1（TIMP-1）antisense RNA on experimental liver fibrosis in rats.Methods TβRI and TIMP-1 antisense RNA eukaryotic expression plasmids were constructed and transfected into experimental rats with hepatic fibrosis.The impacts of TβRI and TIMP-1 antisense RNA on TIMP-1，TβRI and MMP-13 expression were detected by Western blot.Results The relative expressions of TIMP-1 protein in normal control group，antisense TβRI group，antisense TIMP-1 group，combinational group，plasmid group and model group were（23.6±2.8），（57.96±3.8），（62.3±2.8），（34.2±2.8），（279.2±29.8）and（287.3±23.7），respectively；the relative expressions of TβRI in each groups were（56.2±2.7），（70.5.±1.8），（77.0±1.7），（60.6±2.2），（232.0±19.4）and（241.0±18.3），respectively；and the relative expressions of MMP-13 were（17.84±2.3），（36.2±3.7），（41.3±2.4），（28.6±2.0），（127.3±1.2）and（118.5±2.5），respectively.The relative expressions of TβRI，TIMP-1 and MMP-13 in antisense TβRI group，antisense TIMP-1 group and combinational group were significantly decreased compared with normal control group and plasmid group（P＜0.05），while there was no significantly differences between plasmid and model group.Conclusions Antisense TβRI RNA and antisense TIMP-1 RNA can both inhibit the expressions of TβRI，TIMP-1 and MMP-13 protein effectively，and their combination can improve the inhibiting effects.

【Key words】Liver fibrosis；Antisense RNA；Plasmids；Transforming growth factor β receptor；Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases