郭宏儒　（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院　內(nèi)蒙古 通遼　028043）　任秀珍?。▋?nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院）　曹貴方　（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物胚胎與發(fā)育生物學(xué)研究室　內(nèi)蒙古 呼和浩特）

蒙古綿羊Bcl-2基因cDNA的克隆及序列分析

郭宏儒（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院內(nèi)蒙古 通遼028043）任秀珍（內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院）曹貴方*（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物胚胎與發(fā)育生物學(xué)研究室內(nèi)蒙古 呼和浩特）

摘要為擴(kuò)增蒙古綿羊bcl-2基因全序列，根據(jù)GenBank上已公布的牛的序列，設(shè)計了3條引物。從蒙古綿羊脾中提取總RNA,采用RT-PCR，技術(shù)擴(kuò)增出bcl-2的cDNA，并重組到pBlueselectT載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶譜分析和DNA序列測定，證實(shí)所克隆的cDNA為bcl-2，因?yàn)樵揷DNA 包含由687個堿基組成的開放讀碼框（ORF），該ORF 編碼229個氨基酸。經(jīng)比對，與牛的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分別為95.5%和93.4%。

關(guān)鍵詞綿羊Bcl-2基因克隆序列分析cDNA

1972年，Kerr等提出細(xì)胞凋亡的概念，細(xì)胞凋亡（apoptosis）又謂細(xì)胞程序化死亡（programmed cell death，PCD）是一種參與了生物體許多過程的細(xì)胞去除機(jī)制，是由基因編程調(diào)控的細(xì)胞主動自殺過程?？沟蛲龌駼CL2家族的發(fā)現(xiàn)開辟了新一類癌基因—凋亡調(diào)控基因的新紀(jì)元［1］。Bcl-2基因（即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一種原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，并用近年來的一些研究已開始揭示這一作用的機(jī)制。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Bcl-2蛋白家族按功能可分為兩類，一類是象Bcl-2一樣具有抑制凋亡作用，如哺乳動物的Bcl-X1、Bcl-W、Mcl-1、A1、線蟲Ced-9、牛痘病毒E1B119kD等，而另一類具有促進(jìn)凋亡作用，如Bax、Bcl-Xs、Bad、Bak、Bik/Nbk、Bid和Harakiri［2］。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)對象及組織

蒙古綿羊取自于內(nèi)蒙古穆斯林屠宰場。取新鮮脾臟液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2藥品與試劑

瓊脂糖、溴乙錠、總RNA提取試劑盒（Cat.NO.Z5110）購自Promega公司。反轉(zhuǎn)錄RT-PCR試劑盒（Cat.NO.DRR0 19A）、5′RACE試劑盒（Cat.NO.D315）、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和XbaⅠ、T4連接酶、TaKaRa ExTaq DNA Polymerase、DNA Marker為DL2000 （分子量為2000，1000，750，500，250，100）、PMD18-T載體；質(zhì)粒提試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；E.coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室是保存。

1.3PCR引物的設(shè)計與合成

1.3.1bcl-2 cDNA 3′RACE引物3′RACE用引物：反轉(zhuǎn)錄引物（RT-Primer）為試劑盒提供的Oligo dT-Adaptor Primer，該引物含有TaKaRa獨(dú)特設(shè)計的dT區(qū)域及M13 Prime M4部分P2（5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′）。根據(jù)本研究通過RT-PCR已獲得蒙古綿羊Bcl-2的大部分序列和引物設(shè)計原則，并借助計算機(jī)軟件DNAstar進(jìn)行輔助設(shè)計，設(shè)計了一條特異性引物P1（5′-TCATGTGTGTGGA GAGCCTCAA-3′）作為上游引物，下游引物為P2。

1.3.2bcl-2 cDNA 5′RACE引物根據(jù)已獲得蒙古綿羊Bcl-2 cDNA的已知序列設(shè)計兩條反義引物，正義引物為TaKaRa 5′RACE試劑盒提供。第一對PCR引物的正義引物為P3（5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3′），反義引物為P4（5′-TCACCCCGTCCCTGAAGAGA-3′）第二對PCR引物的正義引物為P5（5′-CGCTCCGGAACAGCCTACTGA TGATCAGTCGATG-3′），反義引物為P6（5′-TTGATTTCT CCTGGCTGTCTC-3′）。各引物由上海生工生物工程技術(shù)有限服務(wù)公司合成。

1.4蒙古綿羊脾組織總RNA的提取

采用Promega公司的總RNA提取試劑盒，按其說明進(jìn)行。最后用無RNA酶去離子水溶解RNA沉淀，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.53′RACE PCR循環(huán)

1.5.1cDNA第一條連的合成如上提取蒙古綿羊脾組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組分總體系為10μl：總RNA4.5μl、10×RT buffer 1μl、MgCl2（25mM）2μl、dNTP Mixture（10 mM）1μl、RNase Inhibiter（40U/μl）0.25μl、AMV Reverse Transcriptase Xl（5U/μl）0.5μl、OligdT（2.5μmol/l）0.5μl、RNase Free dH2O 0.25μl、終體積10μl。反應(yīng)條件為：30℃10min、42℃30min、95℃5min、5℃5min，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用作PCR模版。

1.5.2PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)組分總體系為50μl：上述RT溶液10μl、5×PCR Buffer 10μl、TaKaRa ExTaq（5U/μl）0.25μl、 P1（10pmol/μl）1μl、 P2（10pmol/μl）1μl、 dH2O 27.75μl、終體積50μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃3min、94℃30s、61℃30s、72℃45s，35個循環(huán)。

1.5.33′RACE產(chǎn)物的克隆、篩選及鑒定按PCR產(chǎn)物純化試劑盒先將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化，然后用T4連接酶將純化的bcl-2基因cDNA片斷與PMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞后，在含X-gal、IPTG的LB平板培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)14h。選擇白色菌落，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)Hind Ⅲ和Xba I對質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。

1.6套式PCR

1.6.1cDNA第一條連的合成將上述提取的RNA按照5′RACE試劑盒說明處理后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為10μl：Ligated RNA 6μl、Random 9 mers（50μM）0.5μl、5×M-MLV Buffer 2μl、dNTP 1μl、RNase Inhibiter（40U/μl）0.25μl、Reverse Transcriptase M-MLV（200U/μl）0.25μl、終體積10μl。反應(yīng)條件為：30℃10min、42℃1rh、70℃15min，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用作PCR模版。

1.6.2套式PCR套式PCR共進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)。Outer PCR反應(yīng)：上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2μl、1×cDNA Dilution Buffer Ⅱ8μl、5×PCR Buffer 4μl、MgCl2（25mM）3μl、TaKaRa ExTaq（5U/μl）0.25μl、P3（10μM）2μl、P4（10μM）2μl、dH2O28.75μl。總反應(yīng)體系為50μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃3min、94℃30s、55℃30s、72℃45s、72℃1min，35個循環(huán)。Inner PCR反應(yīng)：Outer PCR反應(yīng)液1μl、5×PCR Buffer 5μl、MgCl2（25mM）5μl、dNTP Mixture（2.5mM）8μl、 TaKaRa ExTaq（5U/μl）0.5μl、 P5 （10μM）2μl、P6（10μM）2μl、dH2O26.5μl。總反應(yīng)體系為50μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃3min、94℃30s、57℃30s、72℃45s、72℃1min，35個循環(huán)。

1.6.35′RACE產(chǎn)物的克隆、篩選及鑒定采用的方法與1.5.3相同。

1.6.4DNA序列測定將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。

2　結(jié)果

2.13′RACE的擴(kuò)增

2.1.13′RACE的擴(kuò)增經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，3′RACE產(chǎn)物大小為339bp（見圖1）。

2.1.23′RACE產(chǎn)物的克隆、篩選及鑒定將3′RACE反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物與pBlueselect T載體連接篩選后獲得陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA后經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoR I雙酶切鑒定，證實(shí)含有插入的目的片段（見圖2）。

圖1　bcl-2 cDNA RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖2　重組質(zhì)粒PMD18-T-bcl-2限制性酶切分析

2.25′RACE的擴(kuò)增

2.2.1套式PCR經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，5′RACE產(chǎn)物大小為434bp（見圖3）。

圖3　bcl-2 cDNA RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖4　重組質(zhì)粒 PMD18-T- bcl-2 限制性酶切分析

2.2.25′RACE產(chǎn)物的克隆、篩選及鑒定將5′RACE反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物與pBlueselect T載體連接篩選后獲得陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA后經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切鑒定，證實(shí)含有插入的目的片段（見圖4）。

2.33′RACE產(chǎn)物的序列分析

經(jīng)酶切鑒定正確的質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。3′RACE產(chǎn)物測出338個核苷酸序列，該序列包括C端64個氨基酸編碼序列、終止密碼子TGA、3′UTR 109個核苷酸和poly（A）15。

2.45′RACE產(chǎn)物的序列分析

經(jīng)酶切鑒定正確的質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。5′RACE產(chǎn)物測出434個核苷酸序列，該序列包括C端144個氨基酸編碼序列、翻譯起始密碼子ATG。

2.5bcl-2基因cDNA全長序列分析及同源性比較

在bcl-2 cDNA 部分已知序列的基礎(chǔ)上，通過3′RACE 和5′RACE 分別將bcl-2 cDNA 的3′末端和5′末端 擴(kuò)增完全，得到了806bp的bcl-2 cDNA全序列，并通過DNAstar （Lasergene5.0）推導(dǎo)出228個蛋白質(zhì)的氨基酸序列（見圖5）。

圖5　bcl-2 cDNA的核苷酸全序列及228個氨基酸序列

使用DNAstar分析軟件MegAlign ClustelW（Slow/Accurate）對bcl-2和其他哺乳動物及禽類的bcl-2進(jìn)行cDN堿基序列的同源性比較，bcl-2與牛的同源性最高（95.5%），與貓、人、犬、鼠、分別為88.2%、87.8%、83.5%、82.4%，與雞的同源性最低（52.1%）。這說明綿羊作為反芻動物在bcl-2表達(dá)上具有種屬特異性。另外使用MegAlign軟件對bcl-2和其它動物的bcl-2進(jìn)行氨基酸序列的生物進(jìn)化樹分析（見圖6）。

圖6　bcl-2與人及其它動物bcl-2氨基酸序列生物進(jìn)化樹分析

3　討論

bcl-2是一個多基因家族，目前在哺乳動物中，至少發(fā)現(xiàn)15個家族成員，形成同源或異源二聚體，調(diào)控蛋白酶和核酸酶活性，雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。其中促進(jìn)凋亡的有bcl-Xs、bad、bak、bax等，抑制凋亡的有bcl-2、bcl-XL、Bcg-l等［3］，含有種類和數(shù)量不同的BH（bcl-2homology）結(jié)構(gòu)域。bcl-2蛋白缺乏特征性信號肽但C末端有一個疏水區(qū)，通過其C末端疏水性氨基酸片段錨定于胞膜。以后的研究發(fā)現(xiàn)，這種定位和它們的功能密切相關(guān)［4］。而且有研究表明bcl-2表達(dá)產(chǎn)物可阻止許多刺激物誘發(fā)的細(xì)胞凋亡［5］。其抑制的可能是細(xì)胞凋亡的共同通路。本試驗(yàn)擴(kuò)增出的bcl-2基因經(jīng)不同的剪接方式形成2種不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，即bcl-2α和bcl-2β，但主要是α形式［6］。不同物種bcl-2α所含的氨基酸數(shù)目略有差異，例如雞233個、人239個、大鼠236個，該蛋白C端有一個由19個氨基酸構(gòu)成的疏水序列，為跨膜部分。雞和哺乳動物bcl-2蛋白在C-端和N-端區(qū)域是高度保守的，但中間位置的同源性較差。

本研究通過RT-PCR技術(shù)，成功地擴(kuò)增獲得了綿羊bcl-2基因的cDNA全序列，其中1～693為編碼區(qū)的部分序列，694～806為非編碼區(qū)，這為克隆其他物種bcl-2全序列提供了參考依據(jù)。通DNAStar分析軟件MegAlign ClustelW （Slow/Accurate）對和其他哺乳動物、人及禽類的bcl-2進(jìn)行cDNA堿基序列的同源性比較發(fā)現(xiàn)，該擴(kuò)增序列與牛的核苷酸同源性為95.5%，進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)該基因的部分編碼區(qū)與其他物種具有較高的同源性，與貓、人、犬、鼠、分別為88.2%、87.8%、83.5%、82.4%，但與至今所報道的禽類動物相應(yīng)區(qū)域同源性很低，與雞的同源性為52.1%。非編碼區(qū)的序列與牛的同源性十分高，而人、鼠相應(yīng)的非編碼區(qū)卻很相似，都存在一很長的CA串聯(lián)重復(fù)序列。這說明相似物種同一基因在進(jìn)化過程中更加保守。據(jù)報道，非翻譯區(qū)的遺傳改變（堿基突變）引起了bcl-2的過度表達(dá)，本研究擴(kuò)增出的非翻譯區(qū)序列，可為遺傳突變分析提供依據(jù)。

目前Bcl-2是凋亡分子機(jī)制研究的主要靶分子。隨著對Bcl-2基因序列的測定以及凋亡本身研究的日漸深入，有利于對研究該基因在各種動物上的分子調(diào)控機(jī)制。Bcl-2是作用機(jī)制和凋亡的分子機(jī)制最終被闡明，從而提高對與凋亡有關(guān)的疾病的認(rèn)識和診治水平。

參考文獻(xiàn)

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中圖分類號：S826.8+2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-1733（2015）03-0003-03

收稿日期：（2014–12–08）

*通訊作者