閆茂倉　胡偉麗　張賽樂　王雪鵬

（①浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室　浙江 溫州325005?、跍刂葆t(yī)科大學生命科技學院，浙江 溫州?、蹖幉ù髮W海洋學院　浙江 寧波?、苌綎|農(nóng)業(yè)大學動物科技學院　山東 泰安）

試驗研究

基于卵黃抗體的副溶血弧菌間接ELISA快速檢測方法的建立

閆茂倉①③胡偉麗②③張賽樂①王雪鵬④*

（①浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室浙江 溫州325005②溫州醫(yī)科大學生命科技學院，浙江 溫州③寧波大學海洋學院浙江 寧波④山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院山東 泰安）

摘要本文主要研究了以水產(chǎn)致病性哈氏弧菌為抗原，免疫SPF蛋雞，制備特異性卵黃抗體，從抗體的提取、純化等方面進行了進一步的優(yōu)化研究；建立基于IgY的快速、準確、定量的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測抗原菌濃度的技術(shù)；建立基于IgY的間接ELISA測定抗原濃度的技術(shù)方法，確定抗原包被濃度、一抗IgY和酶標二抗最適稀釋倍數(shù)，抗原包被條件的選擇，底物的最佳反應(yīng)時間等間接ELISA的實驗條件。建立了基于IgY的間接ELISA測定哈氏弧菌的方法，試驗的最佳反應(yīng)條件為：抗原最適工作濃度濃度為1×108cfu/ml，包被4℃過夜；一抗IgY稀釋度分別為1∶28；購買的兔抗雞IgY-HRP酶標抗體作1∶20000稀釋；選擇底物的最佳反應(yīng)時間為20min。

關(guān)鍵詞卵黃抗體副溶血弧菌ELISA快速檢測

目前，國內(nèi)外已經(jīng)開展了大量弧菌病免疫檢測技術(shù)的研究，但是大多是采用全菌苗制備多克隆抗體或多克隆抗體而建立的快速檢測方法，而以主要致病因子作為免疫原、以卵黃抗體為免疫手段等方法建立的快速檢測方法，因其具有較高的專一性和特異性，受到更大的推崇?；诖?，筆者用副溶血弧菌全菌苗制備了特異性卵黃抗體，以此為免疫手段，建立間接ELISA檢測技術(shù)方法，旨在為開展海水養(yǎng)殖動物致病性弧菌的早期快速檢測和防控，為海水養(yǎng)殖動物弧菌病的防治奠定基礎(chǔ)；以及為海產(chǎn)品食品質(zhì)量安全控制提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1IgY的初步分離、提取和純化

按照參考文獻制備。

1.2間接ELISA方法的建立

1.2.1用棋盤式滴定法確定最佳抗原包被濃度和最佳一抗?jié)舛葘?09cfu/ml濃度的副溶血弧菌作系列10倍梯度稀釋至104cfu/ml。每個稀釋度包被3個孔、每孔100μL，4℃過夜。一抗IgY初始濃度為1.97mg/ml，依次作系列10倍稀釋至1∶1010，酶標抗體做1∶20000稀釋，間接ELISA測定。以能產(chǎn)生OD450值為1.0左右，且P/N值（陽性對照OD450值-空白對照OD450值/陰性對照OD450值-空白對照OD450值）最大的抗原稀釋度和抗體稀釋度作為抗原、抗體最適反應(yīng)比［1,2］。

1.2.2酶標二抗最適濃度的確定將抗原、一抗稀釋至最適反應(yīng)比，酶標二抗分別稀釋為1∶10000、1∶15000、1∶20000、1∶25000、1∶30000，其他條件相同，進行間接ELISA檢測。根據(jù)P/N值確定酶標二抗的最適濃度。

1.2.3包被條件的選擇以最佳抗原包被酶標板，包被條件分別為：37℃1h后4℃過夜；37℃2h后4℃過夜；4℃過夜；37℃2h，一抗IgY、酶標二抗為最佳濃度，其他條件相同，進行間接ELISA檢測。根據(jù)P/N值確定最佳包被條件。

1.2.4靈敏度評價副溶血弧菌懸液稀釋梯度為108、107、106、105、104、103、102cfu/ml 為檢測樣品，同時做空白對照和陰性對照。通過比較樣品和陰性對照OD450值，以P/N值≥2.1為最低檢測限。

1.2.5特異性檢測用已經(jīng)建立起的間接ELISA檢測常見的致病性海洋弧菌，例如，副溶血弧菌、哈氏弧菌、鰻弧菌、創(chuàng)傷弧菌。

表1　抗原包被濃度一抗稀釋度　　　?。╟fu/ml）

2　結(jié)果

2.1抗原、一抗最適包被濃度

采用方陣滴定法做抗原和特異性IgY抗體的倍比稀釋，ELISA反應(yīng)結(jié)果見表1。從表中可以看出：當抗原濃度為108和109cfu/ml、一抗?jié)舛葹?∶28時OD450的值均靠近1.0，但抗原濃度為108cfu/ml時OD450的值較大，所以確定抗原濃度為108cfu/ml一抗?jié)舛?∶28。

2.2二抗HRP最佳濃度

表2　HRP酶標二抗的最佳濃度

從表可以看出：當酶標二抗?jié)舛葹?∶15000和1∶20000時，陽性值最接近1.0，而只有在1∶20000P/N值最大，所以確定HRP酶標二抗最佳工作濃度為1∶20000。

2.3包被條件

選擇37℃1h后4℃過夜、常溫1h后4℃過夜、4℃過夜、37℃2h，4種不同的包被條件，測OD值見表3。

表3　不同包被條件

從表3可以看出，當包被液的包被條件為37℃2h時值最接近1.0，且P/N值最大。

2.4靈敏度

副溶血弧菌懸液的稀釋濃度依次為108、107、106、105、104、103、102cfu/ml，各項條件均為最佳條件，進行間接ELISA檢測OD450值，能檢測到103cfu/ml的副溶血弧菌，靈敏度高。

2.5特異性

用已經(jīng)建立起來的間接ELISA檢測幾種常見的致病性海洋弧菌及常見細菌：副溶血弧菌、哈氏弧菌、鰻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。 發(fā)現(xiàn)只能檢測到副溶血弧菌，其他細菌皆為陰性，表現(xiàn)出了較高的特異性。

3　討論

ELISA方法是利用抗體的選擇性和酶標記的化學放大的靈敏性而建立起來的，其反應(yīng)條件是影響檢測結(jié)果的重要因素。本實驗是利用自制免疫的特應(yīng)性IgY建立間接ELISA法檢測抗副溶血弧菌實驗過程中，對包被抗原及一抗的濃度、包被緩沖液及包被條件、封閉緩沖液及封閉時間、酶標二抗的稀釋度、酶標抗體作用的時間、底物作用的時間等實驗條件進行了優(yōu)化。本試驗為利用免疫學方法檢測抗原菌奠定了基礎(chǔ)。

3.1包被抗原濃度及包被條件對ELISA檢測方法的影響

包被液中的蛋白質(zhì)濃度在0.1～2000mg/L，均能吸附在聚苯乙烯塑料板上，但濃度過高時蛋白質(zhì)分子間的相互作用力妨礙了聚苯乙烯載體表面與蛋白質(zhì)的吸附，在ELISA測定法操作的一系列溫育、洗滌過程中，固相吸附的蛋白質(zhì)不斷地被釋放到液相中去，造成實驗的非特異性。但是如果包被液中蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體表面不能被蛋白質(zhì)完全覆蓋，相繼加入的待測標本和酶結(jié)合物的蛋白也部分的非特異性的吸附于聚苯乙烯表面，最后產(chǎn)生的非特異性顯色而影響檢測結(jié)果。為避免這些問題，必須選擇最適包被蛋白濃度，即吸光度為1.0左右，但P/N值最大。本實驗證明，選用全菌抗原稀釋到108cfu/ml時，P/N值最大，試驗特異性較高。進行ELISA實驗時，包被的質(zhì)量是影響抗原-抗體反應(yīng)的重要因素。其中，包被溫度與時間對結(jié)果影響很大，如果溫度低則相應(yīng)延長包被時間；相反，溫度高，則可縮短包被時間。通常認為4℃包被過夜與37℃包被2h具有相同的包被效果。本試驗采用的是4℃包被過夜。

3.2間接ELISA法在基于IgY應(yīng)用于檢測弧菌的優(yōu)缺點

隨著免疫學檢測技術(shù)的出現(xiàn)，ELISA方法已發(fā)展成較成熟的檢測技術(shù)。ELISA方法的最大特點就是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板吸附抗原或者抗體，使之固化，在其中進行免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)，而且可同時對大量樣品進行處理和檢測。此方法具有選擇性好、操作簡便、靈敏度高、價格便宜、實用性強等優(yōu)勢，彌補了經(jīng)典化學方法和其他一起測試手段的不足，正因為以上優(yōu)勢而廣泛的應(yīng)用到很多領(lǐng)域中能對樣品進行定性、定量和半定量的測定。雖然ELISA檢測方法具有很多優(yōu)點，但是也存在一些不足，例如樣品較多的時候，加樣品和洗滌的過程中，如果沒有多孔加樣器或者實驗者操作手法不熟練，勢必造成首先添加和最后添加的孔操作時間上相差許多，造成結(jié)果平行性不好和不準確，操作時需要注意此方面的影響因素從而安排好實驗量；酶標抗體及其他抗體的主要成分都是蛋白質(zhì)，切忌反復凍融使蛋白質(zhì)變質(zhì)而失去了其活性功能，所以要分裝保存，試驗出現(xiàn)不良結(jié)果時，要考慮是否是由于酶標抗體或其他抗體保存不當而使其失活而造成的。

參考文獻

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［2］ 鄢慶枇, 方恩華, 蘇永全等. 大黃魚溶藻弧菌LPS的間接ELISA檢測［J］. 臺灣海峽, 2004, 23（1）∶ 56-61.

［3］ Davey M L, Hancock R E W, Mutharia L M. Influence of culture conditions on expression of the 40 kilodolton porin protein of Vibrio anguillarum serotype O2［J］. Appl. Enciron. Microbiol., 1998,64∶ 138-146.

中圖分類號：S852.4+3

文獻標識碼：A

文章編號：1007-1733（2015）03-0001-02

收稿日期：（2014–11–17）

基金項目：浙江省科技計劃項目（2012C22072，2012F20029，2009F20009）；中央財政支持地方高校發(fā)展專項學科項目（xkc11011）；溫州市重點科技創(chuàng)新團隊項目（C2012004-02）；浙江省南美白對蝦產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系；國家產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系溫州綜合試驗站（CARS-47）；國家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系浙江綜合試驗站（CARS-48）；浙江省重大科技專項（2012C12017-3，2012C1300 5）；溫州市科技計劃項目（2011N0006）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系貝類創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-19）

*通訊作者