在中藥作用機(jī)理研究中分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用

劉小丹

(黑龍江迪龍制藥有限公司 黑龍江安達(dá) 151400)

從古至今,中藥一直是我國(guó)人民進(jìn)行疾病防治的主要手段,對(duì)于整個(gè)民族的繁衍生息產(chǎn)生了極其重要的作用。中醫(yī)藥在其發(fā)展的歷程中,一方面積累了寶貴且豐富的治療經(jīng)驗(yàn),另一方面也逐步構(gòu)建了一套成熟完整的中醫(yī)學(xué)理論體系。但是對(duì)于中醫(yī)藥的作用機(jī)理,卻一直沒(méi)有科學(xué)的語(yǔ)言闡釋,因此難以被世界所廣泛接受。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的持續(xù)發(fā)展,研究生命科學(xué)的方式實(shí)現(xiàn)了根本上的變革,這為中藥作用的機(jī)理研究提供了的良好的契機(jī)和有力的工具,同時(shí)也使中藥基因轉(zhuǎn)錄水平的機(jī)理研究成為了可能,下面對(duì)相關(guān)的研究與應(yīng)用進(jìn)行如下綜述。

1 RT-PCR技術(shù)

PCR是一種在機(jī)體外部迅速擴(kuò)大增加特定基因或DNA序列的方法,它是由美國(guó)科學(xué)家Mullis在1983年發(fā)明的。RT-PCR是從RNA拷貝擴(kuò)增cDNA的一種方法,其具體操作過(guò)程是:首先反轉(zhuǎn)RNA并錄成cDNA,再經(jīng)過(guò)PCR加以擴(kuò)增,從而使它的敏感性得以有效提高,針對(duì)dot blot或Northern blot中含有的目的mRNA不高的問(wèn)題,這一技術(shù)可以有效解決。例如:鄭小偉等人為了對(duì)二仙湯治療腎陽(yáng)虛證的作用機(jī)理進(jìn)行有效的闡釋,在各不相同的時(shí)間范圍內(nèi),研究了二仙湯對(duì)于患有腎陽(yáng)虛的大鼠垂體促腎上腺皮質(zhì)激素基因表達(dá)所產(chǎn)生的影響,最終的研究結(jié)果表明:二仙湯可以上調(diào)垂體組織ACTH的基因表達(dá),而且用藥的時(shí)間如果被延長(zhǎng),那么其表達(dá)量就會(huì)得到增加,這可以反映出上調(diào)ACTH mRNA表達(dá),是利用二仙湯對(duì)腎陽(yáng)虛證進(jìn)行治療的作用機(jī)理之一;β地中海貧血是一種具有遺傳性和溶血性的貧血病,補(bǔ)腎生血膠囊可以益髓、生血、補(bǔ)腎,對(duì)于治療雜合子患者效果比較顯著。為了對(duì)其分子機(jī)理進(jìn)行揭示,吳志奎等人利用RT-PCR的相關(guān)技術(shù),研究了使用補(bǔ)腎生血膠囊的患者的α、β和γ珠蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平,最終得出的研究結(jié)果認(rèn)為,補(bǔ)腎生血膠囊能夠有效地促進(jìn)患有β地中海貧血的患者血紅和抗堿血紅蛋白,以及Hb珠蛋白鏈比的明顯增加,相應(yīng)地升高了γ珠蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平,這表明有關(guān)的補(bǔ)腎生血的中藥對(duì)于γ珠蛋白的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的促進(jìn)是非成有力的,而且可以通過(guò)誘導(dǎo)促進(jìn)HbF的合成,同時(shí)也代償了β珠蛋白基因所具有的缺陷。

2 DDPCR技術(shù)

梁鵬等人于1992年創(chuàng)立了DD PCR技術(shù),具體說(shuō)就是一種利用PCR技術(shù),對(duì)來(lái)源各異的mRNA樣品里面的多種cDNA基因一并進(jìn)行擴(kuò)充增加與表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法。具體說(shuō)就是:采用錨定反義和隨機(jī)正義這兩種類型不同的合成寡核苷酸引物,通過(guò)把具有不同來(lái)源的擴(kuò)增cDNA產(chǎn)物的電泳帶譜進(jìn)行對(duì)比,能夠發(fā)現(xiàn)表達(dá)存在差異的基因。在中藥作用機(jī)理研究的過(guò)程中,唐發(fā)清等人主要探索了益氣解毒片如何干預(yù)鼻咽癌患者細(xì)胞基因的表達(dá),旨在立足于具有選擇性特征的基因表達(dá)水平,研究益氣解毒片對(duì)于鼻咽癌進(jìn)行防治的機(jī)理,最終得出研究結(jié)論:益氣解毒片能夠在患者的機(jī)體外有效地抑制鼻咽癌細(xì)胞基因的表達(dá),除此之外,也可以誘導(dǎo)某些特異基因的表達(dá),最終控制鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)展。

3 核酸分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)在目前的分子生物學(xué)領(lǐng)域是最基本的,其主要的應(yīng)用原理為:基于特定的條件,2條核酸單鏈(具有一定的同源性)通過(guò)堿基互補(bǔ)退火形成雙鏈。雜交的對(duì)象主要是待測(cè)核酸序列與探針,其中核酸被提取分離后在體外與探針進(jìn)行雜交的被稱為印跡雜交,而在組織細(xì)胞內(nèi)直接進(jìn)行雜交被稱為原位雜交。在研究中藥作用機(jī)理的過(guò)程中常用的比較早的有印跡雜交、點(diǎn)雜交和原位雜交。例如:二仙湯主要用于婦女更年期綜合征的治療,屬于抗衰老的知名方劑,廖柏松等人利用核酸分子雜交技術(shù),研究18月大的雌性大鼠下丘腦內(nèi)阿片肽的基因表達(dá)水平,得出的研究結(jié)論認(rèn)為:二仙湯組β內(nèi)啡肽前體阿黑皮素原和腦啡肽原的mRNA水平得到了顯著的提高,與未衰老前的水平相當(dāng)。因此,可以得出這樣的結(jié)論:二仙湯本身所具有的抵抗衰老的功能,是借助于增強(qiáng)抗氧化酶基因表達(dá)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

4 DNA陣列技術(shù)

該技術(shù)屬于新近發(fā)展的,能夠數(shù)千個(gè)基因表達(dá)譜同時(shí)進(jìn)行分析,其原理與核酸分子雜交相同。其稱謂在不同的文獻(xiàn)里邊是不一樣的,例如稱作DNA芯片、微陣列和基因芯片等,目前區(qū)分不明確,一般情況下是混用的。

目前,在對(duì)于中藥基因表達(dá)水平進(jìn)行的研究中,零星地采用商用或自制微陣列。例如:周聯(lián)等人利用小鼠基因(含有2 048個(gè)基因)的表達(dá)譜芯片,來(lái)對(duì)黃連解毒湯進(jìn)行檢驗(yàn)測(cè)試,旨在研究探索其怎樣影響小鼠脾細(xì)胞的基因表達(dá)。測(cè)試得出結(jié)論:復(fù)方要比有效成分所具有的作用大得多,但是對(duì)基因表達(dá)的具體影響進(jìn)行分析還具有相當(dāng)?shù)碾y度;王廣良等人采取自制的cDNA微陣列(含有24個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因),研究了抵抗肝癌腫瘤的四種中藥(烏藥、青蒿、紫草和黃芪)分子的機(jī)制,認(rèn)為它們都程度不同地使細(xì)胞的生長(zhǎng)周期與檢測(cè)的損傷點(diǎn)基因帶來(lái)了改變,其具體表現(xiàn)為部分地上調(diào)和下調(diào),對(duì)于分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行比較,充分地證明了利用四種中藥治療癌癥有其天然的合理性。

在中藥作用于人體的機(jī)理研究中,應(yīng)用DNA陣列技術(shù)可以同時(shí)對(duì)使用中藥前后的數(shù)千個(gè)基因表達(dá)的具體情況進(jìn)行比較,并分析它們之間存在的差異,而且其優(yōu)點(diǎn)也是比較明顯的,例如:用于研究的樣品使用量不多、操作的自動(dòng)化水平比較高、接受測(cè)試的對(duì)象具有較高的DNA密度等。但是微陣列技術(shù)目前同時(shí)也具有很多的問(wèn)題,例如該技術(shù)的高通量與小型化能夠敏銳地感覺(jué)到外界和內(nèi)部的變化,因此有必要采用平均值配合標(biāo)準(zhǔn)化的辦法進(jìn)行操作,但是截至目前仍然沒(méi)有得到業(yè)界普遍認(rèn)可操作標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)則來(lái)規(guī)范指導(dǎo)微陣列實(shí)驗(yàn),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集分析的方法與相關(guān)的操作系統(tǒng)也大不相同。除此之外,基因表達(dá)和調(diào)控研究處于落后狀態(tài),導(dǎo)致難以解釋在研究中藥機(jī)理中所得到的很多信息,制作費(fèi)用的昂貴也限制了這一技術(shù)的發(fā)展。