加味銀杏飲聯(lián)合骨髓干細(xì)胞移植對(duì)大鼠心肌損傷的影響

鄒瑾　李雅+　尹進(jìn)

摘要：目的 制作大鼠心肌損傷模型，采用加味銀杏飲聯(lián)合骨髓間干細(xì)胞（BoneMesenchymalstemcells，BMSCs）移植干預(yù)，觀察心肌細(xì)胞凋亡、心功能，從而探討加味銀杏飲的作用機(jī)制。方法 采用松開左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎的方法建立大鼠心肌損傷的模型，將大鼠分為移植組、加味銀杏飲聯(lián)合移植組等兩組，觀察心肌毛細(xì)血管密度（MCD）、心肌纖維化。結(jié)果 聯(lián)合移植組與單純移植組大鼠心功能均有所改善，而加味銀杏飲聯(lián)合移植組改善更明顯。其AI較單純移植組明顯減少，而缺血區(qū)MVD 明顯增加。結(jié)論 在心肌損傷大鼠模型中，加味銀杏飲聯(lián)合細(xì)胞移植可以減少梗死區(qū)面積，增加梗死區(qū)心室厚度，促進(jìn)梗死區(qū)血管再生，改善心功能；同時(shí)，加味銀杏飲干預(yù)能促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞增殖，比單純細(xì)胞移植效果明顯；加味銀杏飲聯(lián)合細(xì)胞移植能增加移植BMSCs的存活率，在改善大鼠心功能，促進(jìn)血管再生，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖方面優(yōu)于細(xì)胞移植組和中藥組。

關(guān)鍵詞：骨髓干細(xì)胞；心肌損傷；加味銀杏飲；移植好

心肌損傷是心肌的壞死，病情兇險(xiǎn)。目前治療手段主要以藥物和冠狀動(dòng)脈介入手術(shù)為主，這些手段在一定程度上可以緩解患者的癥狀，但均難從根本上解決問題，本實(shí)驗(yàn)采用加味銀杏飲聯(lián)合骨髓干細(xì)胞移植治療實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌損傷，以觀察其療效并探討其可能的作用機(jī)制。具體實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物2 月齡SD大 鼠 3 只（制備MSCs用），雄性，體質(zhì)量 （100±20）g；健康成年SD大 鼠16只，雄性，體質(zhì)量 （250±20）g，中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.1.2藥物銀杏飲組（銀杏30g、檀香5g、砂仁5g）和加味銀杏飲組（銀杏20g，檀香6g，砂仁5g，赤芍10g，川芎6g，當(dāng)歸6g，紅花6g，生地12g，黃芪20g），由湖南株洲中醫(yī)院藥劑科提供 。

1.1.3 主要儀器與試劑 小動(dòng)物呼吸機(jī)、二氧化碳孵箱（HERA cel 1），激光共聚焦顯微鏡，percol1 分離液（pharmacia 公司），F(xiàn)12～DMEM 培養(yǎng)基、進(jìn)口胎 牛血清 （JIBCO 公司），BrdU （pharmacia 公司），小 鼠抗 BrdU單克隆抗體，小鼠抗大鼠CD31單克隆抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗，HP5500 超聲診斷儀，TUNNEL 試劑盒 （武漢博士德生物技術(shù)公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組 成年SD大鼠20只分為加味銀杏飲聯(lián)合移植組 與單 純移植組，造模前分別灌服等體積加味銀杏飲浸膏干粉溶劑以及生理鹽水進(jìn)行灌服14d。

1.2.2干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及純化 研究中將3只幼齡大鼠殺死，將其浸泡在75%的乙醇中，浸泡時(shí)間控制在5min，然后采用PBS對(duì)大鼠體進(jìn)行有效的沖洗，然后去下大鼠的股骨、脛骨等組織并將其放在平皿中，更換相關(guān)器械，將大鼠周圍肌肉組織除去，并采用PBS沖洗。將大鼠骨干的兩個(gè)關(guān)節(jié)面去除，使得骨髓腔充分暴露，并采用7號(hào)針頭將兩骨端進(jìn)行穿刺，利用5 mL10%FBS的 F12～DbIEM 沖出骨髓入離心管，1500 r/min 離心10 min。棄上清，用 F12～DMEM重懸細(xì)胞，輕輕疊加到新鮮配制的密度為1.073的percol 1分離液上，然后進(jìn)行30min離心，離心速度控制在2500 r/min，取上層渾濁液，并采用PBS進(jìn)行2次洗滌，最后使用F12～DMEM 培養(yǎng)液 （培養(yǎng)液中主要有10%胎牛血清、100U/mE青霉素等）重懸細(xì)胞，按1×10 /mE密度進(jìn)行接種，37 ℃、5%飽和濕度的c0。孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)5d后更換培養(yǎng)液，并將未貼的細(xì)胞壁去除。接近融合的MSCs用含 0.1 mmo l/LEDTA 的 0.25%胰酶室溫消化，按 1：3 比例傳代，傳至第3代。MSCs回植前48h ，換用含 5 ～unol/L 5～BrdU的F12～DbIEM 培養(yǎng)液培養(yǎng) 。臨用前加入 0.25%胰蛋 白酶消化 ，然后進(jìn)行離心，并搜集目標(biāo)細(xì)胞，并根據(jù)情況調(diào)整細(xì)胞密度。

1.2.3造模 在15d左右采用O1ivette方法對(duì)兩組法術(shù)進(jìn)行分析，并建立冠狀動(dòng)脈建立急性心肌損傷模型。建模過程中采用50mg/kg 戊巴比妥對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，并建立靜脈通道，讓大鼠心臟完全暴露，采用以4～0 無損傷線進(jìn)行灌裝動(dòng)脈前支結(jié)扎。兩組大鼠進(jìn)行1h后結(jié)扎，并且在直視下采用微量注射器在大鼠心肌梗死周圍進(jìn)行標(biāo)記，并植入標(biāo)記 5～BrdU 的 MSCs（5 ×10個(gè)細(xì)胞/100 pL），每點(diǎn) 25，關(guān)胸。

1.2.4 缺血區(qū)微血管密度檢測(cè) 冰凍切片 PBS 沖洗兩遍，加入1：50 抗 CD31 小鼠單抗，放在溫度為4℃下過夜，PBS 洗滌后加 1 ：50 FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG，37 ℃孵育 50 m in，洗 片后用伊文氏蘭復(fù)染，50%緩沖甘油封片。于熒光顯微鏡下觀察 CD31 陽性細(xì)胞，CO31 陽性細(xì)胞胞漿呈綠色，采用高倍鏡視野對(duì)大鼠毛細(xì)血管進(jìn)行觀察，并采用CD31 陽性數(shù)表示，每張取5個(gè)視野。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 搜集的數(shù)據(jù)采用SPSS16軟件分析，計(jì)數(shù)資料行卡房檢驗(yàn)，采用n（%）表示，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，采用（均數(shù)±方差）表示，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞變化 接種后的細(xì)胞24h可見較多圓形細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中，48 h可見貼壁細(xì)胞，較懸浮細(xì)胞體積大，大小較均一，核大多為圓形，位于細(xì)胞中央。8～9d 后，部分細(xì)胞成梭形，個(gè)別成三角形。換液后 5～7d 基本融合鋪滿，至第 3 代，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形集落樣分布，形態(tài)較均一。

2.2組大鼠移植后4w心肌缺血區(qū)微血管密度檢測(cè) 400 倍視野下，聯(lián)合移植組微血管密度即CD31 陽性細(xì)胞（243±20.3）。較單純移植組 （197±12.6） 明顯增加（P<0.05）。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，通過冠脈或心肌局部注射將 MSCs 導(dǎo)入心肌缺血的微環(huán)境中?？梢苑只癁檠軆?nèi)皮細(xì)胞 （Ec）。促進(jìn)局部血管新 生。達(dá)到 改善 心肌 缺血 目的，從而成 為心血 管領(lǐng)域 的研究熱點(diǎn)。新生血管的形成可降低梗死灶周邊肥大心肌細(xì)胞的凋 亡，挽救有活力的心 肌細(xì)胞，減少膠 原沉著 ，改善心功 能 。但由于 MSCs 在體內(nèi)缺血微環(huán)境中的分化效率有限，因此，是否存在一種方法可以提高 MSC s 的分化效率，增加血管新生，提高療效呢？ 本實(shí)驗(yàn)旨在觀察和探討應(yīng)用加味銀杏飲聯(lián)合 MSCs 移植可否促進(jìn) MSC s 向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，從而提高局部 MvD，改善心功能，降低心肌細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：加味銀杏飲聯(lián)合移植組心功能改善更為明顯，且聯(lián)合移植組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較單純移植組明顯降低，MvD 明顯增加。表明加味銀杏飲具有協(xié)助 MSCs 移植 治療心肌 損傷 、提高局部微血管密度、改善心功能、減少心肌細(xì)胞凋亡的作用，可望為臨床協(xié)助 MSCs 移植增加療效提供一種安全、有效的治療手段 。

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編輯/馮焱