李英，張曉鋒，候英敏，孫玉梅

?

超聲波破碎發(fā)酵性絲孢酵母提取蛋白酶條件的研究

李英，張曉鋒，候英敏，孫玉梅

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034)

發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporon fermentans)所產(chǎn)蛋白酶為胞內(nèi)酶，要提取蛋白酶需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎。利用超聲波破碎發(fā)酵性絲孢酵母細(xì)胞，研究超聲波工作條件對(duì)提取蛋白酶活性的影響。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定提取蛋白酶的適宜條件為輸出功率550 W、工作總時(shí)間13 min、超聲波每次輻射時(shí)間7 s(間歇時(shí)間5 s)、每克細(xì)胞緩沖液加入量20 mL，在此條件下提取的蛋白酶活力達(dá)到393.78 U·g-1。

發(fā)酵性絲孢酵母；蛋白酶；超聲波；細(xì)胞破碎

0 引言

破碎細(xì)胞是提取胞內(nèi)產(chǎn)物的必需途徑，常用的細(xì)胞破碎方法有高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎、化學(xué)滲透法、酶溶法。其中，超聲波破碎法具有省時(shí)高效、操作簡單、液量損失小、無污染等優(yōu)點(diǎn)，但超聲波在細(xì)胞破碎過程中產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)可以使一些敏感的活性物質(zhì)失活[1,2]。因此，研究最佳的超聲波破碎條件對(duì)提取胞內(nèi)活性物質(zhì)具有重要意義。目前，研究超聲波破碎酵母細(xì)胞的最佳條件多為：輸出功率500~600 W，工作總時(shí)間5~20 min，每次輻射時(shí)間3~6 s，間歇時(shí)間2~5 s[3-6]。

發(fā)酵性絲孢酵母能合成脂肪酶、蛋白酶等多種酶，而蛋白酶的生成會(huì)影響脂肪酶的生物合成和生物催化活性。本研究采用超聲波法破碎發(fā)酵性絲孢酵母，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)測定超聲波輸出功率、工作總時(shí)間、每次輻射時(shí)間以及細(xì)胞緩沖液加入量對(duì)提取蛋白酶活性的影響，研究超聲波破碎發(fā)酵性絲孢酵母提取蛋白酶的最佳工作條件，為發(fā)酵性絲孢酵母蛋白酶的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporon fermentans)：CICC1368，購自中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨10，瓊脂20，pH自然，1.0×105Pa下滅菌15 min。

液體種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨5.3，酵母膏2.0，尿素2.0，MgSO40.5，pH自然，0.5×105Pa下滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨1.8，酵母膏0.5，KH2PO42，植物油10 mL，吐溫80 5 mL，pH自然，0.8×105Pa下滅菌20 min。

1.1.3 試劑與儀器

試劑各種試劑均為市售化學(xué)純或分析純的化學(xué)試劑以及生物試劑。

儀器JY98-ШN超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；501型超級(jí)恒溫器，上海試驗(yàn)儀器廠；722S可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

菌種活化培養(yǎng)：將4 °C保存的酵母菌種接于固體斜面培養(yǎng)基上，于30 °C培養(yǎng)48 h。

液體種子培養(yǎng)：將活化菌種接入液體種子培養(yǎng)基中，于30 °C、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量10%，于30 °C、160 r/min搖床培養(yǎng)60 h。

1.2.2 發(fā)酵液和細(xì)胞的處理

發(fā)酵液于4 °C、10000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀。用pH 6.8的磷酸鹽緩沖液將菌體重懸，再次離心，重復(fù)三次。最后再用磷酸鹽緩沖液懸浮菌體細(xì)胞，使菌體沉淀(g)與緩沖液體積(mL)之比為1: 20制得細(xì)胞懸浮液。

超聲波處理細(xì)胞：取20 mL上述細(xì)胞懸浮液，在超聲波功率400 W、總時(shí)間5 min、工作時(shí)間6 s、時(shí)間間隔5 s 的條件下，于冰浴中進(jìn)行破碎處理，得到的細(xì)胞破碎液于4 ℃、10000 r/min離心10 min，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行做三次，得到的上清液即為粗蛋白酶液。

1.2.3 蛋白酶活力的測定

采用福林法[7]測定蛋白酶活力。分別測定發(fā)酵上清液、破碎細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞破碎液及蛋白酶粗酶液的蛋白酶活力。

蛋白酶活力定義：在40 ℃、pH 7.2 的條件下，1 g菌體制備的蛋白酶粗酶液每分鐘催化酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為一個(gè)活力單位。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵性絲孢酵母蛋白酶存在位置的確定

發(fā)酵液和細(xì)胞組分的蛋白酶活力如表1所示。由表1可知，發(fā)酵上清液無蛋白酶活力，可以推斷發(fā)酵性絲孢酵母所產(chǎn)蛋白酶不是分泌的胞外酶。根據(jù)破碎細(xì)胞懸浮液無酶活而超聲破碎后的細(xì)胞破碎液具有較高酶活力，可以推斷發(fā)酵性絲孢酵母所產(chǎn)蛋白酶不在細(xì)胞外壁，為胞內(nèi)酶。

表1 發(fā)酵液和細(xì)胞組分的蛋白酶活力

2.2 超聲波輸出功率對(duì)蛋白酶活力的影響

在超聲波每次輻射時(shí)間為6 s、間隙時(shí)間為5 s以及超聲波處理總時(shí)間為5 min的條件下，研究超聲波輸出功率對(duì)蛋白酶活性的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，超聲波功率為200~500 W時(shí)蛋白酶活力隨著超聲波輸出功率的增加而逐漸增大。這是由于輸出功率的增加使液體中形成較多的空穴，進(jìn)而產(chǎn)生更多的空化泡，使破碎作用增強(qiáng)。400~600 W時(shí)超聲波輸出功率的增加對(duì)蛋白酶活力影響不大。選擇蛋白酶活力最高的超聲波輸出功率500 W為適宜的輸出功率。這與盧群[6]等人的研究結(jié)果相似。

2.3 超聲波處理總時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響

在超聲波輸出功率為500 W、間隙時(shí)間為5 s以及超聲波每次輻射時(shí)間為6 s的條件下，研究超聲波處理總時(shí)間對(duì)蛋白酶活性的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，超聲波處理總時(shí)間為2~15 min時(shí)，蛋白酶活力隨著超聲波處理總時(shí)間的延長而增大。超聲波處理總時(shí)間為15 min時(shí)蛋白酶活力達(dá)到最大，超過20 min時(shí)，蛋白酶活力迅速下降，是由于超聲波破碎細(xì)胞過程中處理液局部有一定升溫，導(dǎo)致酶液失活。超聲波處理總時(shí)間延長至10 min后，蛋白酶活力增加的幅度已不太明顯，考慮到經(jīng)濟(jì)性，選擇超聲波處理總時(shí)間為10 min。

在高功率的超聲波處理10~20 min的過程中，發(fā)酵性絲孢酵母蛋白酶表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶在超聲波介質(zhì)(200 W)中水解酪蛋白可獲得較高的水解率[8]。因此，發(fā)酵性絲孢酵母蛋白酶在超聲波反應(yīng)介質(zhì)中的應(yīng)用值得深入研究。

2.4 超聲波輻射時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響

在超聲波輸出功率為500 W、間隙時(shí)間為5 s以及超聲波處理總時(shí)間為10 min的條件下，研究超聲波每次輻射時(shí)間對(duì)蛋白酶活性的影響，結(jié)果見圖3。由圖 3 可知，每次輻射時(shí)間低于6 s時(shí)，蛋白酶活力明顯下降，是由于輻射時(shí)間太短，空化效應(yīng)起不到爆裂破壁的效果[9]。超聲波輻射時(shí)間高于8 s時(shí)，蛋白酶活力迅速下降，因較長時(shí)間的超聲波輻射使得細(xì)胞破碎液局部產(chǎn)生大量熱量，導(dǎo)致酶液失活。選擇蛋白酶活力最高的超聲輻射時(shí)間6 s為適宜的超聲波輻射時(shí)間。

2.5 細(xì)胞緩沖液加入量對(duì)蛋白酶活力的影響

稱取5份濕菌體，用磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)懸浮細(xì)胞，制成細(xì)胞懸浮液，使每克細(xì)胞緩沖液的加入量分別為10、20、30、40、50 mL。在超聲波輸出功率500 W、超聲輻射時(shí)間6 s、間隙時(shí)間5 s以及超聲處理總時(shí)間10 min的條件下，研究細(xì)胞緩沖液加入量對(duì)蛋白酶活性的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨細(xì)胞緩沖液加入量的增加，蛋白酶活力呈先升高后降低的趨勢。每克細(xì)胞緩沖液加入量為20 mL·g-1時(shí)蛋白酶活力最大。超聲波在水中傳遞時(shí)能量損失較大，較低的細(xì)胞濃度不利于超聲波能量的傳輸，進(jìn)而影響細(xì)胞破碎效果；而在細(xì)胞濃度過高時(shí)，細(xì)胞破碎液粘稠不利于空化泡形成、膨脹和爆炸，導(dǎo)致細(xì)胞破碎效果較差[9]。因此選擇每克細(xì)胞緩沖液加入量為20 mL·g-1。

2.6 超聲波處理?xiàng)l件正交試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，以蛋白酶活力為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)見表2，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表 4。由表4可知，各因素對(duì)酶活的影響順序?yàn)椋篋輸出功率>A細(xì)胞的緩沖液加入量>B超聲波處理總時(shí)間>C超聲波輻射的時(shí)間，綜合表3的k值選擇細(xì)胞破碎工藝參數(shù)為D2A2B2C3，即輸出功率為550 W、超聲波工作總時(shí)間為13 min、每克細(xì)胞的緩沖液加入量為20 mL及超聲波每次輻射時(shí)間為7 s(間歇時(shí)間5 s)。

按正交試驗(yàn)確定的細(xì)胞破碎最佳工藝條件D2A2B2C3，以蛋白酶活性為指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。在此條件破碎細(xì)胞三次并測定蛋白酶活力，所得蛋白酶活力平均值為393.78 U·g-1，高于正交試驗(yàn)的蛋白酶活力最大值375.86 U·g-1。所以認(rèn)為正交實(shí)驗(yàn)得出的最優(yōu)水平是可靠的。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 方差分析

3 結(jié)論

發(fā)酵性絲孢酵母所產(chǎn)蛋白酶為胞內(nèi)酶。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，測定超聲破碎發(fā)酵性絲孢酵母細(xì)胞的工藝條件為輸出功率550 W，工作總時(shí)間13 min，超聲波每次輻射時(shí)間7 s(間歇時(shí)間5 s)，每克細(xì)胞緩沖液加入量為20 mL。在高功率超聲波破碎細(xì)胞過程中，發(fā)酵性絲孢酵母蛋白酶表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，因此發(fā)酵性絲孢酵母蛋白酶在超聲波反應(yīng)介質(zhì)中的應(yīng)用值得深入研究。

[1] 修志龍, 姜維, 蘇志國. 細(xì)胞破碎技術(shù)的研究進(jìn)展和發(fā)展方向[J]. 化工進(jìn)展, 1994(1): 15-21.

XIU Zhilong, JIANG Wei, SU Zhiguo. Research progress and development tendency of cell disruption technique[J]. Chemical Industry and Engineering Progress, 1994(1): 15-21.

[2] ZHANG H F, YANG X H, ZHAO L D, et al. Ultrasonic-assisted extraction of epimedin C from fresh leaves of epicedium and extraction mechanism[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2009, 10(1): 54-60.

[3] 屈慧鴿, 于小飛, 張玉香, 等. 白葡萄酒廢酵母蛋白及多糖的提取工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(9): 315-318.

QU Huige, YU Xiaofei, ZHANG Yuxiang, et al. Study on extraction techniques of protein and polysaccharide from waste yeast of white wine[J]. Chinese Food Science, 2007, 28(9): 315-318.

[4] 江凌, 田小群, 朱明軍, 等. 啤酒廢酵母殘余內(nèi)源蛋白酶活力的測定及其對(duì)酵母自溶的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2007, 28(12): 82-84.

JIANG Ling, TIAN Xiaoqun, ZHU Mingjun, et al. Determine the activity of the residue endogenic protease and the effect of the yeast autolysate from waste brewer yeast[J]. Science and Technology of Food Industry, 2007, 28(12): 82-84.

[5] 王迪, 曹方, 欒靜, 等. 超聲波破碎法提取發(fā)酵性絲孢酵母胞內(nèi)脂肪酶的條件優(yōu)化[J]. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 31(6): 405-408.

WANG Di, CAO Fang, LUAN Jing, et al. Optimization of ultrasonic disruption for lipase extraction from Trichosporon fermentans[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2012, 31(6): 405-408.

[6] 盧群, 劉曉艷, 丘泰球, 等. 超聲對(duì)酵母細(xì)胞膜通透性的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(9):14-17.

LU Qun, LIU Xiaoyan, QIU Taiqiu, et al. Effect of ultrasound on membrane permeability of saccharomyces cerevisiae[J]. Food and Fermention Industries, 2005, 31(9): 14-17.

[7] 上海市釀造科學(xué)研究所. SB/T 10317-1999 蛋白酶活力測定法[S]. 北京: 中國國家標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1999.

Shanghai Brewing Science Institute. SB/T 10317-1999 Assay for proteinase activity[S]. Beijing: The National Stangdard of Publishing House, 1999.

[8] 丁莎莉, 張永忠. 超聲波法混合蛋白酶水解酪蛋白制備酪蛋白磷酸肽的研究[J]. 中國乳品工業(yè), 2007, 35(11):13-14.

DING Shali, ZHANG Yongzhong. Study of producing CPPs by the hydrolysis of casein by hydrolyzing casein with ultrasound[J]. China Dairy Industry, 2007, 35(11): 13-14.

[9] 周麗珍, 李冰, 李琳. 超聲處理對(duì)酵母細(xì)胞的致死及相關(guān)影響[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2007, 35(12): 122-125.

ZHOU Lizhen, LI Bing, LI Lin. Inactivation of yeast cells by ultrasound disinfection and related influences[J]. Journal of South China of University of Technology: Natural Science Edition, 2007, 35(12): 122-12.

Conditions of extraction protease from Trichosporon fermentans by ultrasonication

LI Ying, ZHANG Xiao-feng, HOU Ying-min, SUN Yu-mei

(School of Biological Engineering Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, Liaoning, China)

The cell discruption is essential toextracting intracellular protease of Trichosporon fermentans. Ultrasonication was used to disrupt cells and the effect of ultrasonic condition on the activity of protease extracted was examined. The intracellular protease was extracted more efficiently in 20 mL phosphate buffer per gram of wet cell of Trichosporon fermentans by irradiating ultrasound of 550 W for total working time of 13 min with a 5 s break following each 7 s irradiation.Under the optimal ultrasonic condition, the activity of protease extracted could reach 393.78U·g-1.

trichosporon fermentans; protease; ultrasonication; cell disruption

TS201.3 Q556.3

A

1000-3630(2015)-03-0233-04

10.3969/j.issn1000-3630.2015.03.009

2014-03-21;

2014-07-26

遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(LT2011008)

李英(1991－), 女, 山東樂陵人, 碩士, 研究方向?yàn)槲⑸锎x控制發(fā)酵。

孫玉梅, E-mail: sunyumei62@163.com