人參總RNA提取方法及反轉(zhuǎn)錄酶的比較

張濤+韓梅+劉翠晶等

摘要： 為了探索人參根、葉片總RNA的提取方法，以多年生人參根、葉片為材料，比較7種提取方法的總RNA質(zhì)量。結(jié)果表明：除改良CTAB法對(duì)人參根總RNA的提取效果不明顯，其余方法均能從人參根、葉片中提取、分離到總RNA，其中 RNAPure 高純總 RNA 快速提取試劑盒法能提取到完整性較好、純度較高的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳顯示的條帶清晰完整，根中RNA的D260 nm/D280 nm為1.87，RNA濃度為351.8 ng/μL；用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒、PrimeScript Reverse Transcriptase試劑盒、GoScript TM Reverse Transcription System試劑盒對(duì)提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，其中用GoScript TM Reverse Transcription System試劑盒反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳條帶較亮，證明轉(zhuǎn)錄效果較好。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、PCR證明，提取的總RNA適用于后續(xù)的分子試驗(yàn)研究。

關(guān)鍵詞： 人參；根；葉片；總RNA；提取方法；反轉(zhuǎn)錄酶

中圖分類號(hào)： S567.5+10.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0034-04

人參為五加科人參屬植物，素有“東北三寶”的美譽(yù)，人參皂苷為人參的主要藥效成分，具有較好的抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、改善心腦血管供血不足、抑制細(xì)胞凋亡等藥理活性 [1-3]，目前人們已經(jīng)從人參中分離到了約90個(gè)人參皂苷單體 [4-5]。人參皂苷的含量是判斷人參質(zhì)量的主要標(biāo)準(zhǔn)，但是目前對(duì)人參功能基因和次生代謝生物合成途徑的研究相對(duì)較少，人參皂苷的產(chǎn)率較低，次生代謝產(chǎn)物人參皂苷尚未實(shí)現(xiàn)人工合成，對(duì)于一些含量甚微的單體皂苷的新藥開發(fā)還較為困難 [6]。人參皂苷的生物合成途徑與功能基因表達(dá)量之間的關(guān)系仍處于探究階段 [7]，因此深入了解人參皂苷的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)理，并在分子水平上實(shí)現(xiàn)人參皂苷的人工合成，這是利用生物技術(shù)手段大量生產(chǎn)人參皂苷的必要前提。

為了探究人參皂苷生物合成途徑與功能基因表達(dá)量之間的關(guān)系，首要的問題是提取完整性好、純度高的總RNA。由于植物細(xì)胞組成成分復(fù)雜多樣，使得植物組織總RNA的提取難于其他生物材料。成熟的人參組織中含有大量的酚類、糖類，人參組織的研磨過程破壞了酚類物質(zhì)與多酚氧化酶的平衡分布，酚類極易被氧化成醌，并易與RNA分子發(fā)生不可逆結(jié)合，產(chǎn)生褐化反應(yīng) [8]，從而影響RNA的提取，導(dǎo)致RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量較差。本研究比較了7種提取人參根、葉片總RNA的方法，篩選出適合提取人參根、葉片總RNA的提取方法，并用該方法提取出完整性好、純度高的總RNA。反轉(zhuǎn)錄可以檢測提取的總RNA質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄酶的不同直接決定反轉(zhuǎn)錄效果，本試驗(yàn)比較了3種反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)總RNA的轉(zhuǎn)錄情況，篩選出轉(zhuǎn)錄效果較好的方法，為人參皂苷合成途徑中功能基因的克隆與功能研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

五年生人參取自吉林省撫松縣撫南林場（42°03′06″N，127°33′21″E，海拔903 m），用刀將根部切成小塊，放入凍存管迅速用液氮冷凍，于-80 ℃保存待用，葉片進(jìn)行同樣處理，試驗(yàn)所用部位為人參根、葉片。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 TaKaRa MiniBEST總RNA提取試劑盒（TaKaRa，大連）；多糖多酚植物總 RNA快速提取試劑盒、RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒（BioTeke，長春）；RNeasy Plant Mini 試劑盒（Qiagen，德國）；EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊，北京）；Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、PrimeScript Reverse Transcriptase 2個(gè)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）；GoScript TM Reverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，北京）；異硫氰酸胍；DEPC（焦磷酸二乙酯）；CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）；DL2000 DNA Marker（TaKaRa，大連）；生化試劑酚、三氯甲烷、異戊醇等均為國產(chǎn)分析純。試驗(yàn)中所用的塑料制品如 Eppendorf 管、槍頭等均為RNase free制品，玻璃器皿、研缽等于180 ℃干熱滅菌8 h。

1.2.2 儀器 ND 2000超微量核酸蛋白測定儀（德國K&A公司）；Eppendorf Mastercycler nexus PCR儀（西班牙Cene Amp）；DYY-8C瓊脂糖凝膠電泳儀（北京市六一儀器廠）；GIS-2010凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；HC-2518R 高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；MDF-382E超低溫冰箱（日本SANYO）等。

1.3 總RNA提取

1.3.1 改良CTAB法 [9] 取約100 mg材料，加液氮研磨成粉后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5 mL離心管中，加入10×質(zhì)量濃度的 CTAB（臨用時(shí)加入1% β-巰基乙醇），充分懸浮，于65 ℃水浴10 min；加入等體積三氯甲烷 ∶ 異戊醇（體積比=24 ∶ 1），輕輕混勻，14 000 r/min 離心10 min；取上清，加入等體積三氯甲烷 ∶ 異戊醇（體積比=24 ∶ 1），輕輕混勻，14 000 r/min 離心10 min；取上清，加入1/4體積3 mol/L LiCl，-80 ℃ 放置2 h；從冰箱中取出，[JP2]待液體在冰上溶解，于4 ℃、14 000 r/min 離心10 min；棄上清，加入適量TE，沉淀溶解混勻后，于4 ℃、14 000 r/min離心10 min；取上清，加入等體積飽和酚，充分混勻，于室溫、14 000 r/min 下離心10 min；取上清，加入等體積酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 異戊醇（體積比=25 ∶ 24 ∶ 1）， 充分混勻，于室溫、14 000 r/min下離心10 min；取上清，加入等體積三氯甲烷 ∶ 異戊醇（體積比=24 ∶ 1），充分混勻，于室溫、14 000 r/min下離心10 min；取上清，加入1/4體積LiCl，于 -80 ℃ 放置2 h；從冰箱中取出，待液體在冰上溶解，于4 ℃、14 000 r/min 下離心15 min；棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀，于4 ℃、14 000 r/min下離心10 min；棄上清，待乙醇揮發(fā)后加入40 μL滅菌的DEPC水溶解沉淀，將所得的RNA溶液于 -80 ℃ 保存。

1.3.2 酸性-異硫氰酸胍-三氯甲烷法 取100 mg材料，加液氮研磨成粉，將粉末狀組織轉(zhuǎn)移至裝有1 mL變性溶液D（在293 mL水中加入250 g異硫氰酸胍、17.6 mL 0.75 mol/L 檸檬酸鈉、26.4 mL 10%十二烷基肌氨酸鈉溶液，在可加熱的磁力攪拌器上于65 ℃下攪拌，直到所有成分溶解后于室溫存放）的[JP2]Eppendorf管中，在1 mL溶液D中按順序加入0.1 mL 2 mol/L 乙酸鈉（pH值4.0）、1 mL苯酚、0.2 mL三氯甲烷 ∶ 異戊醇=49 ∶ 1，蓋緊離心管，顛倒數(shù)次，充分混勻；漩渦振蕩器上劇烈振蕩10 s，然后將離心管于冰上放置15 min，于 4 ℃、9 000 r/min 下離心20 min；取上清，加入等體積的異丙醇，混勻后于-20 ℃放置至少1 h，于4 ℃、9 000 r/min下離心 30 min；小心將異丙醇倒掉，第1步中每用1 mL溶液D，就用0.3 mL溶液D；將溶液轉(zhuǎn)移到1個(gè)離心管中漩渦振蕩，加入等體積的異丙醇，于-20 ℃放置至少1 h；于4 ℃、12 000 r/min 下離心10 min，用 75%乙醇洗滌沉淀2次，再次離心，用移液器吸去殘留的乙醇，將離心管敞口在工作臺(tái)上放置數(shù)分鐘，使乙醇揮發(fā)；加入40 μL DEPC處理過的水，將RNA溶液于-80 ℃保存。

1.3.3 相關(guān)試劑盒的操作 Takara MiniBEST總RNA提取試劑盒、多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒、RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒、EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒、RNeasy Plant Mini 試劑盒的操作分別參照相應(yīng)的說明書進(jìn)行。

1.4 總RNA質(zhì)量的檢測

1.4.1 總RNA完整性的檢測 取5 μL從上述方法中提取的總RNA樣品，在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，180 V 恒壓 10 min，于凝膠成像儀中成像，在紫外燈下觀察RNA條帶，并照相記錄。

1.4.2 總RNA純度與產(chǎn)率檢測 取2 μL用以上方法提取的總RNA樣品，于ND2000超微量核酸蛋白測定儀上檢測，記錄總RNA濃度值、D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm，并計(jì)算產(chǎn)率。

1.5 cDNA的合成

Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒、PrimeScript Reverse Transcriptase試劑盒、GoScript TM Reverse Transcription System試劑盒的操作均參照相應(yīng)的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 cDNA的檢測

用PrimeScript Reverse Transcriptase試劑盒、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒、GoScript TM Reverse Transcription System試劑盒對(duì)RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒提取的根總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA [10]。以得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：7.4 μL 去離子水，10 μL 2×Taq PCR Mix，各0.8 μL上、下游引物，1 μL模板RNA 。反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性30 s，52 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。取4 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳上檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳總RNA完整性檢測

由圖1可見，用不同方法從人參根部、葉片提取的總RNA中，除改良CTAB法、酸性-異硫氰酸胍-三氯甲烷法沒有清晰的條帶，其余方法均可見28S、18S等2條電泳條帶。與其他幾種方法相比，RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒法提取的根部、葉片總RNA條帶清晰明亮、穩(wěn)定，28S條帶的寬度約為18S的2倍，說明該方法提取的總RNA質(zhì)量較高、完整性較好。酸性-異硫氰酸胍-三氯甲烷法、改良CTAB法提取的根部總RNA電泳結(jié)果中基本上沒有看到RNA條帶，而這2種方法提取的人參葉片總RNA電泳圖譜的亮度較弱，獲得率較低，有明顯的DNA、蛋白污染；Takara MiniBEST總RNA提取試劑盒法圖譜條帶亮度較弱、獲得率低，存在蛋白污染，但是它對(duì)DNA的消除較徹底；多糖多酚植物總RNA快[CM（25]速提取試劑盒法圖譜較為清晰、明顯拖帶，有明顯的

降解現(xiàn)象，對(duì)多酚多糖的消除效果較好；EASY spin Plus 植物RNA快速提取試劑盒法圖譜模糊、明顯拖帶，存在DNA、蛋白污染，有明顯的RNA降解現(xiàn)象；RNeasy Plant Mini 試劑盒法圖譜較為清晰、明顯拖帶，存在DNA污染，有明顯的RNA降解現(xiàn)象。

2.2 總RNA純度檢測

將用TaKaRa MiniBEST總RNA提取試劑盒、多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒、EASY spin Plus 植物RNA快速提取試劑盒、RNeasy Plant Mini 試劑盒、RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒、酸性-異硫氰酸胍-三氯甲烷法、改良CTAB法提取的總RNA在超微量核酸蛋白檢測儀上檢測，結(jié)果如表1所示。

當(dāng)D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0時(shí)，D260 nm/D230 nm值接近2.0，表明RNA樣品較純凈。由表1可見，用TaKaRa MiniBEST總RNA提取試劑盒、多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒、EASYspin Plus 植物RNA快速提取試劑盒、RNeasy Plant Mini 試劑盒、酸性-異硫氰酸胍-三氯甲烷法、改良CTAB法提取的根或葉片總 RNA D260 nm/D280 nm值都有接近20[JP2]的。TaKaRa MiniBEST總RNA提取試劑盒、EASY spin Plus 植物RNA快速提取試劑盒提取的葉片以及改良CTAB 法提取的根總RNA D260 nm/D280 nm的值≥2.2，說明有核苷酸降解。

RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒提取的根、葉片總RNA D260 nm/D280 nm分別為187、2.02，在1.8～2.0之間，說明可以去除蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的干擾。用 RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒提取的根、葉片總RNA D260 nm/D230 nm分別為2.06、1.88，用RNeasy Plant Mini 試劑盒提取的葉片總RNA D260 nm/D230 nm為212，接近2.0，說明RNA純度高，不存在多糖、蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)等雜質(zhì)。而其余方法提取的根、葉片總RNA D260 nm/D230 nm均低于2.0，說明受到基因組DNA的干擾，不能有效地去除其中的萜類化合物等次生代謝物，這與電泳結(jié)果相符。

TaKaRa MiniBEST總RNA提取試劑盒、多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒、EASY spin Plus 植物RNA快速提取試劑盒、酸性-異硫氰酸胍-三氯甲烷法、改良CTAB法5種方法獲得的根、葉片總RNA濃度都較低（表1），RNeasy Plant Mini 試劑盒、RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒獲得的根、葉片總RNA濃度相對(duì)較高，用RNeasy Plant Mini 試劑盒提取，獲得根、葉片的濃度分別為117.8、170.4 ng/μL，而RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒獲得的根、葉片產(chǎn)率分別為351.8、287.4 ng/μL（表1）。后者濃度之所以相對(duì)較高是因?yàn)樗?dú)有的裂解液可以有效地消除基因組污染、穩(wěn)定性好，而且沒有異丙醇、乙醇洗滌過程，RNA可以直接從離心柱上洗脫，避免了過去干燥不易溶解的問題，因此其RNA產(chǎn)率相對(duì)較高。

2.3 不同反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的檢測

以PrimeScript Reverse Transcriptase試劑盒、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒、GoScript TM Reverse Transcription System試劑盒對(duì)RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒提取的人參根總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，采用[WTBX][STBX]PgSS1 [STBZ]基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。

經(jīng)PrimeScript Reverse Transcriptase試劑盒、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒、GoScript TM Reverse Transcription System試劑盒對(duì)人參根總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，根據(jù)已報(bào)道的人參[WTBX][STBX]PgSS1 [STBZ]基因設(shè)計(jì)引物：[WTBX][STBX]PgSS1 [STBZ]F，5′-

AAATGGGAAGTTTGGGGGC-3′；[WTBX][STBX]PgSS1 [STBZ]R，5′-GGGTTCTCACTGTTTGTTCAG-3′；在PgSS1基因的引物下進(jìn)行的PCR均能得到1條堿基數(shù)在1 000～2 000 bp之間的片段，且條帶清晰；而經(jīng)GoScript TM Reverse Transcription System試劑盒反轉(zhuǎn)錄的cDNA擴(kuò)增出的片段亮度明顯高于PrimeScript Reverse Transcriptase試劑盒、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒，而且沒有拖帶現(xiàn)象，證明其專一性比較強(qiáng)，反轉(zhuǎn)錄效率較高，但是3種方法得到的cDNA均可用于后續(xù)的分子研究。

3 結(jié)論與討論

提取完整性好、純度高的RNA是進(jìn)行Northern雜交分析、基因克隆、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、建立cDNA文庫、基因功能分析等分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵。本試驗(yàn)通過對(duì)幾種不同提取人參根、葉片總RNA的方法進(jìn)行比較，以期找出1種高效、快速且適合提取人參總RNA的方法，為后續(xù)的研究提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)經(jīng)驗(yàn)。

由于人參中含有多糖、酚類的影響，采用改良CTAB法和酸性-異硫氰酸胍-三氯甲烷法從人參中提取的總RNA質(zhì)量不好。隨著人參的生長和成熟，多糖、多酚的含量也隨之提高，這些都會(huì)給人參總RNA的提取及后續(xù)試驗(yàn)造成很大的障礙，成熟的人參中含有大量的酚類物質(zhì)，在有氧的條件下，酚類極易被氧化成醌并易與RNA分子產(chǎn)生不可逆的結(jié)合，進(jìn)而干擾RNA的提取過程 [11-12]。RNase 是一種核酸內(nèi)切酶，對(duì)RNA有水解作用，但對(duì)DNA不起作用，RNase非常穩(wěn)定，在試驗(yàn)中研磨破碎細(xì)胞的過程中，內(nèi)源RNase會(huì)造成RNA的酶解；試驗(yàn)過程中操作的速度、手法對(duì)RNA的降解也較嚴(yán)重。因此，無論是內(nèi)源RNase還是外源RNase都會(huì)使提取的RNA發(fā)生降解，它是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)，給試驗(yàn)帶來很大的困難 [13]。人參中還含有較多的多糖、蛋白質(zhì)，而多糖的結(jié)構(gòu)與 RNA相近，很難將它們分離開，所以在去除多糖的同時(shí)RNA也會(huì)被帶走，造成RNA產(chǎn)量下降 [14]，而在沉淀RNA時(shí)，可能形成多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA很難溶于水，或溶解后產(chǎn)生黏稠狀溶液，而且多糖抑制了許多酶的活性，因此人參根的含糖量比葉片高，所以同種方法提取的葉片RNA明顯好于根 [15]。蛋白質(zhì)對(duì)RNA的污染也是一個(gè)重要因素，因而要獲得高質(zhì)量的 RNA就要盡可能地去除蛋白質(zhì)，在沉淀蛋白質(zhì)環(huán)節(jié)中盡量不要吸附到沉淀，因?yàn)槲廴玖硕嗵?、蛋白質(zhì)的RNA樣品很難用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。

本試驗(yàn)采用酸性-異硫氰酸胍-三氯甲烷法、改良CTAB法提取人參根、葉片的總RNA質(zhì)量較差，而TaKaRa MiniBEST總RNA提取試劑盒的提取過程中加有DNase1消化，有效地去除了基因組DNA的干擾，多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒可有效地去除多糖多酚對(duì)RNA的影響，EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒獨(dú)有的DNA消除柱可有效地去除基因組DNA的干擾，RNeasy Plant Mini 試劑盒使用了硅基質(zhì)膜，以增強(qiáng)對(duì)RNA的吸附能力。以上方法雖然能得到完整性較好的RNA，但含有的雜質(zhì)較多，并且降解較多，說明其不適用于人參材料總RNA的提取。而 RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒簡單、便捷，其獨(dú)有的裂解液可有效地裂解組織液，使其得到純度高、完整性好、產(chǎn)率高的總RNA，是提取人參材料總RNA比較理想的方法。本試驗(yàn)比較了PrimeScript Reverse Transcriptase試劑盒、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒、GoScript TM Reverse Transcription System試劑盒對(duì)人參根總RNA反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA 的效果，結(jié)果表明，GoScript TM Reverse Transcription System試劑盒對(duì)RNA的反轉(zhuǎn)錄效果較好，比較適用于人參根部材料，為后續(xù)分子試驗(yàn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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