汪義龍+夏瑩萍+梁建生

摘要： 根據(jù)水稻數(shù)據(jù)庫中過氧化氫酶基因編碼序列設(shè)計(jì)引物，克隆水稻OsCATA基因全長(zhǎng)序列，構(gòu)建無自激活活性的pGBKT7-OsCATA誘導(dǎo)重組質(zhì)粒，采用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選水稻2周齡葉片 cDNA文庫。結(jié)果表明，對(duì)84個(gè)陽性克隆測(cè)序，比對(duì)分析得到13種可能與OsCATA基因存在相互作用的蛋白質(zhì)，這些蛋白與葉綠素合成前體、脅迫相應(yīng)蛋白、核糖體蛋白、外膜蛋白、分泌蛋白、ATP酶和G蛋白β亞基等相關(guān)。不同時(shí)期過氧化氫酶基因表達(dá)分析顯示，OsCATA基因在幼苗期和抽穗期表達(dá)較高，OsCATB基因在乳熟期和完熟期中表達(dá)較高，OsCATC基因在幼苗期和揚(yáng)花期表達(dá)較高。

關(guān)鍵詞： 水稻；OsCATA基因；過氧化氫酶；酵母雙雜交；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：Q786；S511.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0020-04

植物體內(nèi)的H2O2有雙重作用，低濃度的H2O2在干旱 [1]、鹽 [2]和重金屬 [3-4]等脅迫中，可以作為氧化還原信號(hào)分子，調(diào)控基因表達(dá)，產(chǎn)生一系列的防御機(jī)制來保護(hù)細(xì)胞。當(dāng)H2O2含量超過一定限度時(shí)，則導(dǎo)致氧化性損傷，甚至引起程序性死亡 [5-6]。

過氧化氫酶（catalase，EC 1.11.1.6，簡(jiǎn)稱CAT）是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶之一，催化H2O2生成H2O，同時(shí)釋放O2的反應(yīng)。該酶是由4個(gè)亞基組成的四聚體血紅蛋白，按照催化中心結(jié)構(gòu)差異分為2類：鐵卟啉酶和錳過氧化氫酶 [7]。過氧化氫酶主要分布在過氧化物酶體中，在乙醛酸循環(huán)體、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中也有分布 [8-10]。已有研究者報(bào)道，從擬南芥 [11]、水稻 [12]、大麥 [13]、小麥 [14]、玉米 [15]、煙草 [16]、油菜 [17]和馬鈴薯 [18]中克隆到過氧化氫酶基因。對(duì)過氧化氫酶基因定位的研究中，Kamigaki等認(rèn)為C-末端氨基酸區(qū)域作為一個(gè)內(nèi)部定位信號(hào)在過氧化氫酶進(jìn)入過氧化物酶體過程中起著重要作用 [19]。

葉綠體和線粒體中產(chǎn)生的活性氧主要由ASC-GSH系統(tǒng)來清除，而過氧化物酶體中的活性氧主要由過氧化氫酶清除 [20]。在大麥 [21]、煙草 [22]和擬南芥 [23]CAT基因突變體的研究中，發(fā)現(xiàn)由于CAT基因的缺失，在強(qiáng)光或過氧化氫酶抑制劑的處理下，突變體表現(xiàn)出致死的表型。Foyer等認(rèn)為這種致死的表型是由于光呼吸產(chǎn)生的H2O2沒有被及時(shí)清除，在過氧化物酶體中積累，從而產(chǎn)生一系列氧化還原信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡 [24]。Lin等對(duì)水稻OsCATC突變體的研究發(fā)現(xiàn)，在不同條件處理下，其誘導(dǎo)的程序性死亡與細(xì)胞內(nèi)NO信號(hào)相關(guān) [25]。Queval等利用擬南芥[WTBX][STBX]CAT2[WTBZ][STBZ]突變體在不同CO2濃度和不同光周期處理下，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)[WTBX][STBX]CAT2[WTBZ][STBZ]突變體程序性死亡的氧化還原信號(hào)與光周期的關(guān)系更大 [26]。

水稻數(shù)據(jù)庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）中顯示水稻基因組中含有3個(gè)過氧化氫酶基因：OsCATA基因、OsCATB 基因和OsCATC基因。生物信息學(xué)分析表明水稻OsCATA基因與擬南芥[WTBX][STBX]CAT2[WTBZ][STBZ]基因cDNA同源性達(dá)到71%（與[WTBX][STBX]CAT1[WTBZ][STBZ]基因同源性為70%）。目前對(duì)篩選與水稻OsCATA基因相互作用蛋白的研究較少，鑒于OsCATA基因在細(xì)胞內(nèi)氧化還原信號(hào)傳遞過程中的重要作用，對(duì)其功能研究具有重要意義，本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與OsCATA基因相互作用的蛋白，分析過氧化氫酶基因在不同時(shí)期的表達(dá)，以期為了解OsCATA基因在氧化還原信號(hào)傳遞過程中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試水稻為日本晴（Oryza sativa L. spp. japonica cv. Nipponbare），種植于揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)田中，以四周的葉片為材料，提取總RNA，用于pGBKT7-OsCATA誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的構(gòu)建。以不同時(shí)期的葉片為材料，提取總RNA，用于過氧化氫酶基因的表達(dá)分析。

1.2 試劑

總RNA提取試劑盒：RNAprep pure Plant Kit（TIANGEN）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo scientific）；熒光定量PCR試劑盒：SYBR Green SuperMix（BIO-RAD）；瓊脂糖電泳DNA回收試劑盒：AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（杭州愛思進(jìn)生物公司）；質(zhì)粒抽提試劑盒：質(zhì)粒小量制備試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；TA試劑盒：pMD19-T Simple Vector（TaKaRa）；大腸桿菌DH5α感受態(tài)制備為CaCl2法；酵母細(xì)胞感受態(tài)通過 LiAc 法制備；Taq DNA聚合酶：Thermo Scientific DreamTaq Green DNA聚合酶；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。日本晴水稻2周齡葉片cDNA文庫已連接在pGADT7-Rec載體上，并轉(zhuǎn)化酵母Y187菌株，由趙淑玲博士惠贈(zèng) [27]；酵母AH109菌株購自北京拜爾迪公司；雙雜交質(zhì)粒：pGBKT7，pGADT7 購自C lontech公司；酵母 YPDA 培養(yǎng)基、缺陷型培養(yǎng)基購自北京泛基諾公司；X-α-gal 購自Inalco公司。

1.3 水稻總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)植物總RNA提取試劑盒說明書，提取4周齡的日本晴葉片的總RNA，并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，以5 μL的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于pGBKT7-OsCATA誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的構(gòu)建。提取不同時(shí)期日本晴葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于過氧化氫酶基因的表達(dá)分析。

1.4 誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

在水稻數(shù)據(jù)庫中搜索OsCATA基因（LOC_Os02g02400）的編碼序列，用Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。以逆轉(zhuǎn)錄獲得的水稻葉片cDNA為模板，PCR擴(kuò)增OsCATA基因的編碼序列。反應(yīng)體系20 μL，其中引物OsCATA_F和OsCATA_R各0.5 μL，10×buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，模板cDNA 1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸100 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳、回收、克隆入pMD19-T質(zhì)粒載體，即pMD19T-OsCATA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)后，PCR鑒定為陽性的菌落送公司測(cè)序。將pMD19T-OsCATA 和pGBKT7質(zhì)粒分別用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切后，經(jīng)20%瓊脂糖凝膠電泳、回收目的片段、連接構(gòu)建成完整的 pGBKT7-OsCATA 重組質(zhì)粒。

1.5 誘導(dǎo)重組質(zhì)粒自激活及毒性檢測(cè)

將誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pGBKT7-OsCATA和獵物空質(zhì)粒pGADT7-EV共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，涂布SD/-Trp/-Leu平板，30 ℃培養(yǎng)4～5 d，挑取SD/-Trp/-Leu平板上生長(zhǎng)較好的單菌落，用50 μL、0.9% NaCl溶液重懸。取10 μL重懸菌液分別滴加在SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal缺陷型培養(yǎng)基上，30 ℃ 培養(yǎng)3～4 d，觀察生長(zhǎng)情況，確定誘導(dǎo)蛋白是否具有自激活。

1.6 cDNA文庫篩選及陽性克隆鑒定

將誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-OsCATA轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，篩選轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y187的水稻2周齡cDNA文庫，涂布50個(gè)平板，按Clontech公司酵母雙雜交操作手冊(cè)檢測(cè)雜交效率，在SD/-Trp/-Leu/-His/+X-α-gal缺陷型培養(yǎng)基上篩選與OsCATA基因存在相互作用的蛋白質(zhì)，初篩的陽性克隆需要重新劃線進(jìn)一步確認(rèn)。挑取已驗(yàn)證為陽性的酵母菌落，使用pGADT7基因引物AD/T7進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、切膠回收并測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行整理分析。

1.7 水稻不同時(shí)期葉片過氧化氫酶基因的表達(dá)分析

以水稻數(shù)據(jù)庫中的過氧化氫酶基因編碼序列為參照，用Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)OsCATA、OsCATB和OsCATC基因定量PCR引物（表1）。以幼苗期、分蘗期、拔節(jié)期、孕穗期、抽穗期、揚(yáng)花期、乳熟期和完熟期等8個(gè)時(shí)期的水稻葉片cDNA為模板，熒光定量PCR擴(kuò)增水稻過氧化氫酶基因，進(jìn)行表達(dá)量分析。反應(yīng)體系20 μL，其中上下游引物各0.5 μL，定量PCR混合液10 μL，模板cDNA 1 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；加溶解曲線程序，導(dǎo)出數(shù)據(jù)使用ABI 7300儀器分析軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建誘導(dǎo)重組質(zhì)粒

以引物OsCATA_F和OsCATA_R（表1）PCR擴(kuò)增水稻OsCATA 基因全長(zhǎng)序列，電泳、回收并克隆到pMD19-T載體中，將測(cè)序正確的pMD19T-OsCATA和pGBKT7質(zhì)粒經(jīng) NdeⅠ 和BamHⅠ雙酶切后，回收目的片段，連接構(gòu)建成完整的誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pGBKT7-OsCATA，重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示。

2.2 誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的自激活及毒性檢測(cè)

2.3 水稻cDNA文庫的篩選結(jié)果

以pGBKT7-OsCATA質(zhì)粒為誘導(dǎo)蛋白，篩選水稻2周齡葉片cDNA文庫，將轉(zhuǎn)化子經(jīng)SD/-Trp/-Leu/-His/+X-α-gal培養(yǎng)板初步篩選并重新劃線確認(rèn)后，共獲得84個(gè)陽性克隆，挑取陽性酵母菌落進(jìn)行菌落PCR，電泳、回收目的條帶送公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在水稻數(shù)據(jù)庫中比對(duì)搜索，表2列出了陽性克隆測(cè)序后比對(duì)出的可能存在相互作用的蛋白的基因號(hào)和注釋。

2.4 不同時(shí)期水稻過氧化氫酶基因的表達(dá)分析

從圖3可見，OsCATA基因在幼苗期和抽穗期表達(dá)略高，在揚(yáng)花期時(shí)表達(dá)最低，是幼苗期的18%。OsCATB基因在乳熟期和完熟期中表達(dá)較高，是幼苗期的1.5倍左右。OsCATC基因的表達(dá)在幼苗期和揚(yáng)花期表達(dá)較高，在乳熟期時(shí)表達(dá)最低，是幼苗期的61%。

3 討論

本研究應(yīng)用Clontech公司的酵母雙雜交系統(tǒng)，構(gòu)建 pGBKT7-OsCATA 誘餌重組質(zhì)粒，篩選水稻2周齡葉片cDNA文庫，通過對(duì)84個(gè)陽性克隆的測(cè)序和序列比對(duì)分析，得到13種可能存在相互作用的蛋白。煙草 [22]和擬南芥 [23]CAT基因缺失材料，表現(xiàn)出顯著的表型，即葉片出現(xiàn)白斑，Lin等在篩選[CM（25]水稻NO信號(hào)相關(guān)突變體時(shí)，發(fā)現(xiàn)了OsCATC突變體，該突變體葉片也出現(xiàn)顯著的白斑，認(rèn)為其與NO信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡相關(guān) [25]。本研究在篩選OsCATA基因互做蛋白時(shí)，篩選出2個(gè)與葉綠素合成前體相關(guān)的蛋白，PSⅡ反應(yīng)中心W蛋白和磷酸-2-脫氫-3-脫氧庚糖酸醛縮酶，為進(jìn)一步研究過氧化氫酶與葉綠素合成、葉片細(xì)胞程序性死亡之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。H2O2是植物細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中的重要組成部分，與植物細(xì)胞衰老與程序性死亡 [28]、氣孔關(guān)閉 [29]、根的生長(zhǎng) [30]、細(xì)胞壁的發(fā)育 [31]、柱頭與花粉的發(fā)育 [32]以及系統(tǒng)獲得抗性 [33]等密切相關(guān)。轉(zhuǎn)基因研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫酶基因缺失的煙草植株，對(duì)病原菌應(yīng)答的敏感性顯著提高 [34]，本研究中篩選出2個(gè)與脅迫響應(yīng)相關(guān)的蛋白——含有應(yīng)激蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白和脅迫響應(yīng)蛋白，有助于分析H2O2和過氧化氫酶在脅迫應(yīng)答信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的作用。另外還篩選出與 OsCATA 可能存在相互作用的蛋白包括外膜蛋白OMP85家族，分泌載體相關(guān)膜蛋白，40S核糖體蛋白、含有1，3-β-葡聚糖合成酶結(jié)構(gòu)域的蛋白、液泡ATP合酶亞基、賴氨酸酮戊二酸還原酶反式剪接相關(guān)因子、G蛋白β亞基WD結(jié)構(gòu)域和含TPR結(jié)構(gòu)域的蛋白等。

不同時(shí)期過氧化氫酶基因的表達(dá)分析說明，不同時(shí)期過氧化氫酶基因表達(dá)差異較大，OsCATA基因在幼苗期和抽穗期表達(dá)略高，OsCATB基因在乳熟期和完熟期中表達(dá)較高，OsCATC 基因的表達(dá)在幼苗期和揚(yáng)花期表達(dá)較高，即不同時(shí)期通過表達(dá)不同過氧化氫酶基因來清除體內(nèi)過多的H2O2。

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