楊文婧　趙瑞力

[摘要] 目的 探討喉鱗狀細(xì)胞癌組織中Twist2、β-cadherin、E-cadherin的表達(dá)及其意義。 方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)Twist2、β-cadherin、E-cadherin在48例喉鱗狀細(xì)胞癌組織及30例癌旁正常組織中的表達(dá)情況，分析其在不同組織中的相互關(guān)系及與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床參數(shù)的關(guān)系。 結(jié)果 Twist2、β-cadherin、E-cadherin在喉鱗狀細(xì)胞癌及癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；喉鱗狀細(xì)胞癌中Twist2、β-cadherin及E-cadherin的陽性表達(dá)率在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；在不同臨床分型及年齡間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；喉鱗狀細(xì)胞癌中Twist2的陽性表達(dá)與β-cadherin的陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.434，P=0.005），與E-cadherin的陽性表達(dá)亦呈負(fù)相關(guān)（r=-0.344，P=0.034）。 結(jié)論 Twist2與β-cadherin、E-cadherin在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，Twist2與β-cadherin、E-cadherin的協(xié)同作用可能影響喉鱗狀細(xì)胞癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞] 喉鱗狀細(xì)胞癌；Twist2；β-cadherin；E-cadherin；免疫組化

[中圖分類號(hào)] R739.65 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2015）08（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significances of Twist2，β-cadherin and E-cadherin in LSCC. Methods The expression of Twist2，β-cadherin and E-cadherin were detected by immunohistochemistry S-P method in 48 tissue LSCC and 30 tumor-adjacent normal tissue.The relationship between three factors and clinical pathological features of LSCC were investigated. Results The differences of the positive rates of Twist2，β-cadherin and E-cadherin in LSCC and tumor-adjacent normal were statistically significant （P<0.01）；the positive expression rates of Twist2，β-cadherin and E-cadherin in lympha node metastasis，clinical stage in LSCC were statistically significant （P<0.05 or P<0.01）；no statistically significant difference between the different clinical type and age groups（P>0.05）.The positive expression of Twist2 was negatively related to that of β-cadherin （r=-0.434，P=0.005），and also negatively related to that of E-cadherin （r=-0.344，P=0.034）. Conclusion Twist2，β-cadherin and E-cadherin play important role in the occurrence，infiltration and metastasis of laryngeal squamous cell carcinoma.The synergistic effect of Twist2，β-cadherin and E-cadherin may have some effects on the infiltration and metastasis of laryngeal carcinoma.

[Key words] Laryngeal squamous cell carcinoma；Twist2；β-cadherin；E-cadherin；Immunohistochemistry

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟的過程。同其他惡性腫瘤一樣，喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生也是多基因、多因素、多條途徑共同參與的復(fù)雜過程，抑癌基因失活與癌基因的激活并存，最終導(dǎo)致了正常細(xì)胞生長(zhǎng)和分化失去控制，所以，目前從基因水平上了解喉鱗狀細(xì)胞癌得到人們的高度重視。Twist2是堿性Helix-loop-helix（b-HLH）蛋白家族中的重要一員，近年來開始被關(guān)注。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，Twist2與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生及腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。但在與喉鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)性研究還尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化S-P法檢測(cè)喉鱗狀細(xì)胞癌及癌旁正常組織中的Twist2、β-cadherin及E-cadherin蛋白的表達(dá)情況，探討其在喉鱗癌的發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移中的作用及三者的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集48例喉鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織30例，均來自于滄州市人民醫(yī)院耳鼻喉科2010年2月～2013年5月的喉鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本和手術(shù)切除的距安全切緣1 cm以上的癌旁正常組織，并均經(jīng)過病理檢查確定。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。所有喉癌患者術(shù)前都未行放、化療，臨床資料完整。喉癌狀細(xì)胞患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例，無淋巴轉(zhuǎn)移者24例；高分化（G1級(jí)）13例，中分化（G2級(jí)）19例，低分化（G3級(jí)）16例；Ⅰ+Ⅱ期患者18例，Ⅲ+Ⅳ期患者30例；聲門上型17例，聲門型31例。年齡41～80歲，中位年齡60.2歲。

1.2 主要試劑

Twist2鼠單克隆抗體（Twist2 C1a：sc-81417，Santa Cruz Biotechnology Inc）；β-cadherin、E-cadherin鼠單克隆抗體（ZM-0094，北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）；鼠二抗免疫組化試劑盒（SP-9002，北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色液（ZLI-9032，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

所選標(biāo)本均制成石蠟標(biāo)本，4 μm連續(xù)切片，一抗所選濃度Twist2、β-cadherin鼠單克隆抗體1∶100；E-cadherin鼠抗人單克隆抗體1∶50。采用免疫組織化學(xué)S-P法，嚴(yán)格遵守操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)置PBS代替一抗為陰性對(duì)照，作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，癌旁正常組織為正常對(duì)照組。

1.4 結(jié)果判定

Twist2在細(xì)胞質(zhì)中陽性著色，陽性著色細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)片狀或顆粒狀的胞質(zhì)。結(jié)果采用半定量記分法判定[1]，按陽性著色程度、陽性細(xì)胞所占比例分別評(píng)分，再用兩者的乘積來判定結(jié)果：<4分為陰性表達(dá)，4～12分為陽性表達(dá)。

β-cadherin、E-cadherin在細(xì)胞膜上陽性著色，陽性細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)呈棕黃色顆粒狀或線狀均勻完整的胞膜著色。判定結(jié)果參考Fromowitz評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[2]，選取5個(gè)高倍視野（×400）得出陽性細(xì)胞百分率；再根據(jù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度予以記分，最后將兩項(xiàng)得分相加：<3分為陰性表達(dá)，≥3分為陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)均經(jīng)Excel整理后采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Twist2在喉鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)

Twist2在喉鱗狀細(xì)胞癌中陽性表達(dá)率為58.33%（28/48），高于癌旁正常組織中陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（16.67%，5/30）（P<0.01）（表1）。在喉鱗狀細(xì)胞癌中，Twist2在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組（N+）的陽性表達(dá)率（83.3%）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組（N0）的陽性表達(dá)率（33.3%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。根據(jù)TNM分期，喉鱗狀細(xì)胞癌Ⅰ+Ⅱ期病例組的陽性表達(dá)率（22.2%）明顯低于Ⅲ+Ⅳ期病例組（80.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而與腫瘤病理學(xué)分級(jí)、臨床分型及年齡分組無關(guān)（P>0.05）（表2）。

β-cadherin在喉鱗狀細(xì)胞癌中陽性表達(dá)率為35.42%（17/48），低于癌旁正常組織中陽性表達(dá)率（100.00%，30/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1）。在喉鱗狀細(xì)胞癌中，β-cadherin在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組（N+）的陽性表達(dá)率（16.7%）明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組（N0）的陽性表達(dá)率（54.2%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。根據(jù)TNM分期，喉鱗狀細(xì)胞癌Ⅰ+Ⅱ期病例組的陽性表達(dá)率（55.6%）明顯高于Ⅲ+Ⅳ期病例組（23.3%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而與腫瘤病理學(xué)分級(jí)、臨床分型及年齡分組無關(guān)（P>0.05）（表2）。

E-cadherin在喉鱗狀細(xì)胞癌中陽性表達(dá)率為22.92%（11/48），低于癌旁正常組織中陽性表達(dá)率（100.00%，30/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1）。在喉鱗狀細(xì)胞癌中E-cadherin的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N+組低于N0組，P<0.01）、臨床分期（Ⅰ+Ⅱ期高于Ⅲ+Ⅳ期，P<0.01）和病理分級(jí)（G2+G3級(jí)低于G1級(jí)，P<0.01）相關(guān)，而與臨床分型及年齡分組無關(guān)（P>0.05）（表2）。Twist2、β-cadherin和E-cadherin在喉鱗狀細(xì)胞癌及癌旁正常組織中的表達(dá)見圖1～圖3。

2.2 Twist2與β-cadherin、E-cadherin在喉鱗狀細(xì)胞癌中的相關(guān)性

在48例喉癌中，Twist2、β-cadherin在5例喉鱗狀細(xì)胞癌組織中均呈陽性表達(dá)，Twist2、β-cadherin在8例喉鱗狀細(xì)胞癌中均呈陰性表達(dá)，Twist2表達(dá)陽性但β-cadherin表達(dá)陰性的喉鱗狀細(xì)胞癌有23例，β-cadherin表達(dá)陽性但Twist2表達(dá)陰性的喉鱗狀細(xì)胞癌有12例。Spearman相關(guān)分析顯示，Twist2與β-cadherin呈負(fù)相關(guān)表達(dá)（r=-0.434，P=0.005）。

在48例喉鱗狀細(xì)胞癌中，Twist2、E-cadherin在3例喉鱗狀細(xì)胞癌組織中均呈陽性表達(dá)，Twist2、E-cadherin在12例喉鱗狀細(xì)胞癌中均呈陰性表達(dá)，Twist2表達(dá)陽性但E-cadherin表達(dá)陰性的喉鱗狀細(xì)胞癌組織有25例，E-cadherin表達(dá)陽性但Twist2表達(dá)陰性的喉鱗癌組織有8例。Spearman相關(guān)分析顯示，Twist2與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)表達(dá)（r=-0.344，P=0.034）。

3 討論

在胚胎的發(fā)育過程中，上皮細(xì)胞之所以會(huì)逃避組織結(jié)構(gòu)所造成的空間限制，是因?yàn)樗鼤?huì)轉(zhuǎn)變成另一種更加合適的細(xì)胞移動(dòng)表型——間充質(zhì)表型，這個(gè)過程即為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)型（EMT）。目前研究發(fā)現(xiàn)，EMT可以使不具有轉(zhuǎn)移潛力和侵襲性的非惡性腫瘤細(xì)胞獲取侵襲的能力，轉(zhuǎn)移至其他器官。EMT被基質(zhì)細(xì)胞外信號(hào)啟動(dòng)，這包括細(xì)胞外基質(zhì)的組成成分和生長(zhǎng)因子，EMT被EMT轉(zhuǎn)錄因子的激活物調(diào)節(jié)，如Twist1、Snail、Slug、ZEB1、ZEB2[3-6]。國外研究表明，Twist2與Twist1類似，可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，導(dǎo)致腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[7]。最近研究發(fā)現(xiàn)，Twist2在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，很可能通過促進(jìn)EMT轉(zhuǎn)變，從而使間葉細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin、fibronectin表達(dá)增多，繼而增加侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[8]。Twist2與甲狀腺癌、乳腺癌的表達(dá)在國內(nèi)外有相關(guān)報(bào)道[9-17]，但其在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)尚未研究。本實(shí)驗(yàn)顯示，Twist2在喉鱗癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率（P<0.01）。在喉鱗癌組織中Twist2陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM臨床分期相關(guān)（P<0.05），但在臨床分型、腫瘤病理學(xué)分級(jí)及年齡分組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。此結(jié)果與毛宇彬等[8]報(bào)道的卵巢癌中Twist2的基因表達(dá)結(jié)果相一致。由此推斷Twist2高表達(dá)的鱗狀細(xì)胞癌組織具有更強(qiáng)的侵襲能力，Twist2可能成為判斷喉鱗狀細(xì)胞癌預(yù)防或預(yù)后的檢測(cè)指標(biāo)之一。

β-cadherin的羧基末端與E-cadherin胞內(nèi)區(qū)結(jié)合，氨基末端與α-cadherin連接可形成E-cadherin/cadherin復(fù)合體從而穩(wěn)定E-cadherin結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞間的黏附連接。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，喉鱗狀細(xì)胞癌中β-cadherin陽性表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，提示喉鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移、侵襲能力越高，β-cadherin的陽性表達(dá)率越低。焦陽等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌中β-cadherin高表達(dá)，并且與臨床分期、門靜脈栓、肝外轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，喉鱗狀細(xì)胞癌中E-cadherin陽性表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，提示喉鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移、侵襲能力越高，E-cadherin的陽性表達(dá)率越低。Rodrigo等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在聲門上型喉癌組織中E-cadherin表達(dá)下調(diào)與喉癌患者的臨床參數(shù)，如頸巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期、組織學(xué)分化程度及腫瘤復(fù)發(fā)均呈負(fù)相關(guān)，提示檢測(cè)喉癌患者的E-cadherin的表達(dá)對(duì)于評(píng)估病情及制訂臨床治療方案有重要意義。

EMT過程中，上皮細(xì)胞經(jīng)歷了重要的表型轉(zhuǎn)變，E-cadherin和其他上皮細(xì)胞功能的組成結(jié)構(gòu)表達(dá)的缺失及侵襲特性使它們轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外基質(zhì)[20]。Twist2形成Twist1/Twist2/Mi2/NuRD蛋白復(fù)合物，其與E-box的啟動(dòng)子結(jié)合，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，導(dǎo)致EMT的發(fā)生[19]。β-catenin與E-cadherin鏈接形成復(fù)合體，對(duì)細(xì)胞間質(zhì)起到穩(wěn)固作用[21]，當(dāng)β-catenin表達(dá)異?；蚬δ軉适r(shí)，與E-cadherin的鏈接就會(huì)喪失，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和侵襲[22]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Twist2、β-cadherin和E-cadherin三者的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Twist2與E-cadherin及β-cadherin均呈負(fù)相關(guān)。Twist2參與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及浸潤可能通過上調(diào)E-cadherin同時(shí)下調(diào)β-cadherin介導(dǎo)發(fā)生EMT。聯(lián)合檢測(cè)喉鱗狀細(xì)胞癌組織中Twist2、β-cadherin和E-cadherin的表達(dá)情況對(duì)患者的診療與預(yù)后具有指導(dǎo)意義。

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（收稿日期：2015-06-11 本文編輯：衛(wèi) 軻）