王亞楠 韓瑩琰 范雙喜卜 斌

（北京農(nóng)學院植物科學技術學院，北京 102206）

紫色葉用萵苣遺傳多樣性及親緣關系的TRAP分析

王亞楠 韓瑩琰 范雙喜*卜 斌

（北京農(nóng)學院植物科學技術學院，北京 102206）

利用TRAP標記對47份紫色葉用萵苣種質(zhì)進行親緣關系及遺傳多樣性分析。20對引物組合共擴增出多態(tài)性條帶430條，多態(tài)性比率（PPB）為67.08%。47份紫色葉用萵苣材料的遺傳相似系數(shù)在0.706 3～0.982 8之間，Nei’s基因多樣性指數(shù)（He）和Shannon’s信息指數(shù)（I）分別為0.255 3和0.397 6，遺傳多樣性水平較低。聚類分析結果表明，47份紫色葉用萵苣材料分為2大類群，第Ⅱ類群又分為5個亞類，葉片形態(tài)相似的種質(zhì)基本上聚在一起，親緣關系較近。

紫色葉用萵苣；TRAP標記；遺傳多樣性

葉用萵苣（Lactuca sativaL.）是菊科萵苣屬一年或二年生草本植物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植（Kristkova et al.，2008），也是菊科植物基因組計劃（Compositae Genome Project，http://compgenomics.ucdavis.edu/）研究的一個重要物種（Truco et al.，2007）。葉用萵苣原產(chǎn)于地中海沿岸，5世紀傳入中國，近年來大規(guī)模栽培，按葉色可分為綠色和紫色兩類，其中紫色葉用萵苣色澤艷麗，營養(yǎng)成分含量較高，富含花青素，具有抗氧化、抗癌、抗心血管病、美容等保健功能（蔣先明，1999），受到育種者和消費者的青睞。

對萵苣屬種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究歐美國家報道較多，多種標記方法都有應用（Hill et al.，1996；Dilpreet et al.，2011）。Kesseli 等（1991）利用RFLP標記對67份萵苣屬種質(zhì)資源進行多樣性分析，否定了栽培萵苣起源于柳葉萵苣（L.saligna）與刺毛萵苣（L. virosa）雜交的假說。van de Wiel等（1999）利用SSR標記推斷出栽培萵苣與野萵苣（L.serriola）的親緣關系較近。Simko（2009）利用EST-SSR標記成功區(qū)分了96份栽培萵苣的不同亞種，并且能區(qū)分開綠色萵苣和紫色萵苣。Uwimana等（2012）利用SSR標記分析了歐洲萵苣屬種質(zhì)資源的居群結構，根據(jù)雜交基因流向判斷出野萵苣在歐洲蔓延迅速的原因。

我國對葉用萵苣的研究主要集中在生理生化方面（范雙喜和伊東正，2002；聞婧 等，2011），關于葉用萵苣遺傳多樣性的研究較少，尤其是紫色葉用萵苣更加少見。李悅（2010）采用系統(tǒng)學和形態(tài)解剖學方法研究了中國萵苣屬及其近緣屬的親緣關系。劉麗娟（2008）利用SRAP標記和形態(tài)標記對50份萵苣材料進行了遺傳多樣性分析，兩種聚類結果具有較好的相關性和符合度。

目標區(qū)域擴增多態(tài)性（target region amplified polymorphism，TRAP） 是 Hu和 Vick在 SRAP技術基礎上，利用EST序列設計定向引物，擴增出與目標基因序列相關的多態(tài)性片段的一項技術，具有操作簡單、重復性好、效率高等優(yōu)點，在種質(zhì)資源鑒定評價、構建遺傳圖譜、重要性狀基因標記、輔助選擇育種與指紋分析等方面都有應用（Hu & Vick，2003；杜曉華 等，2004；Hu et al.， 2005）。

生產(chǎn)上紫色葉用萵苣的栽培和研究水平遠落后于綠色葉用萵苣，而且品種類型和數(shù)量有限，品種更新緩慢。部分種質(zhì)缺乏系譜背景，來源不明，給育種工作帶來不便。同時，各地頻繁引種導致品種混雜、退化現(xiàn)象嚴重。紫色葉用萵苣種質(zhì)資源創(chuàng)新和新基因發(fā)掘亟待解決。本試驗首次對我國紫色葉用萵苣的遺傳多樣性進行研究，利用TRAP標記對47份紫色葉用萵苣種質(zhì)進行親緣關系鑒定和種質(zhì)評價，了解其遺傳背景，為深入挖掘利用種質(zhì)資源、指導親本選配、提高育種效率提供理論 參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試47份紫色葉用萵苣材料由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所國家種質(zhì)資源中期庫、北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心、中蔬種業(yè)科技（北京）有限公司、河北青縣青豐種業(yè)有限公司提供，品種名稱及葉片形態(tài)特征見表1，來源地主要集中在北京和河北，有38份；其余的福建3份、山東2份、美國3份、日本1份。

1.2 試驗方法

2012年2月25日溫室播種，3月28日定植于大棚，每個品種定植1個小區(qū)，25株，株距40 cm，兩側設置保護行，各小區(qū)管理水平一致。依據(jù)萵苣種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準（李錫香和王海平，2006）觀測、記錄葉片性狀。

在幼苗長至5～6片真葉時分別取嫩葉，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。利用植物基因組提取試劑盒（北京鼎國生物技術有限公司生產(chǎn)）提取DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度，并稀釋至30～50 ng·μL-1，-20 ℃冰箱保存待用。

引 物 序 列 參 照 Li和 Quiros（2001）、Hu等 （2005）的方法進行設計，用葉片形態(tài)（葉形、葉面褶皺、葉尖、葉緣）差異較大的羅生1號、紅生1號、立生3號、大橡生1號4個品種進行引物篩選，從60對引物中篩選出多態(tài)性明顯、條帶清晰、重復性好的20對引物組合，對47份紫色葉用萵苣種質(zhì)進行遺傳分析。表2為試驗所用引物序列，表3為TRAP分析所用引物組合。TRAPPCR 反應體系（20 μL）：DNA 模板 2 μL（60～100 ng·μL-1），10×PCR Buffer（Mg2+free）2 μL，Mg2+1.6 μL（2.0 mmol·L-1），dNTP 0.8 μL（0.2 mmol·L-1）， 引 物 1.5 μL（0.75 μmol·L-1），Taq酶 0.2 μL（1.0 U），ddH2O 11.9 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 45 s，35 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，5 個循環(huán)；94 ℃變性 45 s，51 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用6.0%變性聚丙烯酰胺電泳分離，銀染顯帶。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用人工讀帶在膠片觀察燈上觀測結果，根據(jù)引物遷移率和擴增條帶的有、無分別記為1和0，構建二元矩陣。采用POPGEN Version 1.31軟件計算遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)，包括多態(tài)性比率（PPB）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（He）、Shannon’s信息指數(shù)（I）。 根 據(jù) Nei和 Li（1979） 的 方 法， 采 用NTSYS-pc 2.1軟件中的DICE法計算相似系數(shù)；采用UPGMA法進行聚類分析，生成聚類圖。

表1 供試種質(zhì)名稱、來源地、葉片形態(tài)特征及TRAP擴增結果

表2 試驗所用TRAP引物序列

表3 20對TRAP引物組合對47份紫色葉用萵苣材料的擴增結果

2 結果與分析

2.1 TRAP-PCR擴增結果

利用20對引物組合對47份紫色葉用萵苣材料進行TRAP-PCR擴增，擴增片段長度200～1 000 bp；共擴增出641條條帶，其中多態(tài)性條帶430條，平均每對引物獲得21.50條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為67.08%；引物組合QGA7H07R-Sa12擴增出的條帶數(shù)最多，達53條；引物組合GGB9J18R-Sa12擴增條帶的多態(tài)性最高，多態(tài)性比率為97.06%（表3、圖1）。TRAP-PCR擴增能檢測到特異擴增位點的引物有7對，占引物對總數(shù)的35.00%。豐富的多態(tài)性條帶及對品種間稀有遺傳變異的檢測能力表明，TRAP技術對供試紫色葉用萵苣種質(zhì)具有較高的鑒別能力，適合分析該物種的遺傳多樣性。

2.2 遺傳變異性分析

由表1可知，供試47份紫色葉用萵苣材料擴增出的條帶數(shù)在353～453條之間，平均為421條；多態(tài)性條帶數(shù)在146～246條之間，平均為214條。引物擴增結果表明（表3），47份紫色葉用萵苣材料的 Nei’s基因多樣性指數(shù)在 0.187 1～0.314 2 之間，平均為 0.255 3；Shannon’s信息指數(shù)在 0.305 1～ 0.476 1之間，平均為 0.397 6；遺傳相似系數(shù)在 0.706 3～0.982 8 之間，平均為 0.837 0。20 號紅皺羅沙與46號紫色油麥菜、27號紅生1號與46號紫色油麥菜間的遺傳相似系數(shù)最小，均為0.706 3；25號美國紫葉生菜與29號意大利紫葉生菜間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.982 8。47份紫色葉用萵苣種質(zhì)的Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)較低，品種間相似系數(shù)較高，說明供試紫色葉用萵苣材料的多樣性水平較低，遺傳背景狹窄。

圖1 引物組合GGB9J18R-Sa12對47份紫色葉用萵苣材料的擴增結果

從表1還可以看出，2號w32、3號P-B1、13號紅帆、14號P-S6、20號紅皺羅沙、35號橡葉生菜等6份材料檢測到特異性位點，占總數(shù)的12.77%。這表明供試紫色葉用萵苣種質(zhì)雖然多樣性水平較低，但種質(zhì)間依然存在較高的遺傳分化。

2.3 聚類分析

根據(jù)DICE相似系數(shù)，采用UPGMA法構建聚類圖（圖2），在相似系數(shù)0.813處將供試47份紫色葉用萵苣材料劃分為2個類群。

第Ⅰ類群共6份種質(zhì)，為42號、43號、44號、45號、46號、47號，全部為油麥菜類型，葉形偏 長、披針形或長橢圓形，葉面褶皺少，邊緣為不規(guī)則鋸齒狀；其余41份種質(zhì)劃分為第Ⅱ類群，在相似系數(shù)0.828處進一步細分為5個亞類。

第1亞類共17份種質(zhì)，1號和2號為半結球皺葉類型；5號為半結球直立類型；21號、22號、23號、24號、25號、29號、30號、31號的親緣關系較近，形態(tài)上表現(xiàn)為：葉片提琴形或長橢圓形，葉面皺或微皺，葉尖圓或鈍尖，葉緣為不規(guī)則鋸齒狀或鈍齒狀；33號、38號、39號、40號的親緣關系較近，形態(tài)上表現(xiàn)為：葉片深裂宛如橡葉、近圓形、葉面褶皺較少、葉尖為銳尖、葉緣重鋸齒狀，此亞類中的36號、37號也具有相似形態(tài)，但是與這4份種質(zhì)的親緣關系較遠。

第2亞類共18份種質(zhì)，全部為皺葉類型。9 號、10號、11號、12號、14號、16號、17號、18 號、19號、20號、26號的親緣關系較近，形態(tài)上表現(xiàn)為：葉面褶皺多、葉尖較圓、葉緣為重鋸齒狀或細鋸齒狀，此亞類中的13號、15號也具有相似形態(tài)，但與這11份種質(zhì)的親緣關系較遠，其中13號紅帆的親緣關系最遠，是美國引進品種，表現(xiàn)出與國內(nèi)品種的差異；27號、28號與第1亞類中的21號、22號等種質(zhì)形態(tài)相似，32號、34號、41號與第1亞類中的33號、38號等種質(zhì)形態(tài)相似，但是這5份種質(zhì)卻歸為第2亞類，TRAP聚類結果與形態(tài)分類不完全相同可能是因為這幾份種質(zhì)的遺傳背景比較復雜，或者是TRAP所用引物擴增區(qū)域的局限性造成的。

第3亞類包含3號和4號2份種質(zhì)，都是半結球直立類型，亦都是由北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心選育而成。

圖2 47份紫色葉用萵苣種質(zhì)TRAP聚類分析樹狀圖（UPGMA法）

第4亞類共3份種質(zhì)，6號、7號是半結球直立類型，由北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心育成；35號為皺葉類型，來自河北，其形態(tài)與7號相似，葉片倒卵形、葉面微皺、葉尖圓、葉緣呈不規(guī)則鋸齒狀。

第5亞類只有1份種質(zhì)8號，為半結球直立 類型。

聚類結果顯示（圖2），13號、14號、22號、23號等4份國外引進品種與國內(nèi)品種不存在明顯的遺傳差異，表明其有共同的遺傳基礎；供試材料在地理來源聚類上混雜，沒有明顯的規(guī)律性，這與供試種質(zhì)的來源地主要集中在河北及北京地區(qū)有關，也可能是頻繁引種使紫色葉用萵苣種質(zhì)間某些基因相互滲入，打破了種質(zhì)的地域限制。

3 結論與討論

本試驗采用的20對TRAP引物組合在47份紫色葉用萵苣種質(zhì)間均能擴增出條帶，平均每對引物擴增出多態(tài)性條帶21.50條，多態(tài)性比率為67.08%，可見采用TRAP標記檢測紫色葉用萵苣種質(zhì)能產(chǎn)生較多譜帶，多態(tài)性位點豐富，這與Hu等（2005）在萵苣屬種質(zhì)上的擴增結果相似，證明TRAP標記具有穩(wěn)定的重復性。劉麗娟（2008）采用SRAP標記對萵苣屬植物擴增得到的引物多態(tài)性條帶平均為25.58條，表明TRAP標記對紫色葉用萵苣的遺傳分析與SRAP具有可比擬的擴增效率和圖譜。

本試驗采用TRAP標記對47份紫色葉用萵苣材料的親緣關系進行分類，將其劃分為2大類群，第Ⅱ類群又劃分為5個亞類。依據(jù)Lebeda等 （2007）的分類方法可以將紫色葉用萵苣分為脆葉結球萵苣、綿葉結球萵苣、直立萵苣、皺葉萵苣和拉丁萵苣。采用 EST-SSR（Simko，2009）、AFLP（Hill et al.，1996） 和 SAMPL（Witsenboer et al.，1997）等分子標記方法對萵苣屬種質(zhì)資源進行多樣性分析，聚類結果與Lebeda等（2007）的劃分結果一致。本試驗也得到了相似的聚類結果：供試47份紫色葉用萵苣種質(zhì)含有直立萵苣和皺葉萵苣2個類型，TRAP聚類結果基本上將2個類型區(qū)分開了，第1、2亞類主要為皺葉萵苣，第3、4、5亞類主要為直立萵苣。

紫色葉用萵苣的主要食用部位是葉片，葉片性狀是其重要的形態(tài)特征。其中皺葉萵苣類型葉形、葉褶皺、葉尖、葉緣等葉片表型性狀存在較大差異（陳青君 等，2011）。卜斌（2013）對皺葉萵苣23個形態(tài)指標的調(diào)查結果表明，葉尖、葉形、葉緣、葉褶皺等4個指標相似的品種親緣關系較近。本試驗在分子水平上驗證了這一結果，33份皺葉萵苣種質(zhì)中在這4個指標上相似的種質(zhì)基本聚在一起，表明可以依據(jù)這4個葉片性狀對皺葉萵苣進行 分類。

按照植物學分類紫色葉用萵苣可劃分為3個變種：皺葉萵苣（L. sativavar.crispaL.）、結球萵苣（L. sativavar.capitataL.）、直立萵苣（L. sativavar.romanaGars）（蔣先明，1999）。油麥菜近年來栽培較為普遍，它的植物學分類一直有爭議，林辰壹等（2005）通過比較油麥菜、萵苣、菊苣的形態(tài)特征和生長特性認為其是萵苣的一個變種；金波等（2002）則認為油麥菜是菊苣的一個變種。本試驗中，TRAP聚類結果顯示紫色油麥菜（42號、43 號、44號、45號、46號、47號）被劃為第Ⅰ類群，與直立萵苣親緣關系較近，與散葉萵苣親緣關系較遠。由于供試材料覆蓋萵苣變種類型不全面，油麥菜及直立萵苣品種較少，不能確定油麥菜屬于萵苣的哪個變種，需要進一步探討。

本試驗結果表明，供試紫色葉用萵苣種質(zhì)間差異較小，遺傳基礎狹窄，種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)總體偏高，變異范圍在 0.706 3～0.982 8 之間，Nei’s基因多樣性指數(shù)平均為0.255 3，Shannon’s信息指數(shù)平均只有0.397 6。Kesseli等（1991）認為由于多系起源及復雜的馴化過程使萵苣具有豐富的形態(tài)和較高的遺傳多樣性；董潔等（2009）的研究表明紫色散葉萵苣主要數(shù)量性狀變異范圍大，蘊藏著很大的選擇潛力。本試驗結果與這兩者有所不同，可能是因為供試紫色葉用萵苣種質(zhì)類型單一，多為散葉類型，而葉用萵苣的變異主要發(fā)生在不同類型間，同一類型種質(zhì)間親緣關系較近，遺傳多樣性低。造成這種現(xiàn)象的原因一方面是紫色葉用萵苣是自花授粉植物，長期自交繁育使群體內(nèi)基因逐漸純和，遺傳變異減少；另一方面可能是優(yōu)良品種的循環(huán)利用，在商業(yè)化育種中優(yōu)良種質(zhì)資源或相關基因被反復循環(huán)利用是常見的，在相近的種質(zhì)基因庫范圍內(nèi)育種，導致遺傳多樣性的降低，反映在形態(tài)特征上為表型相近。棉花、六倍體大麥等作物由于優(yōu)良種質(zhì)的循環(huán)利用也表現(xiàn)出遺傳多樣性降低（Bowman et al.，1996；van Esbroeck et al.，1998；Mikel，2013）。

遺傳多樣性低這一結果也反映了我國紫色葉用萵苣的育種現(xiàn)狀，目前在國內(nèi)生產(chǎn)中占較大份額的是綠色結球萵苣，紫色葉用萵苣雖然逐漸受到重視，但育種基礎薄弱。此外，中國不是葉用萵苣的起源中心，品種多為國外引進，后來選育的品種也多為進口品種的衍生后代，自主育成的紫色葉用萵苣品種很少。同時，由于頻繁引種，紫色葉用萵苣存在同物異名或同名異物現(xiàn)象，如25號美國紫葉生菜與29號意大利紫葉生菜兩個品種來自不同的種子公司，但遺傳相似系數(shù)為0.982 8，很可能是同物異名。在今后的育種工作中應充分挖掘、利用含有特異等位基因的品種，選擇遺傳差異大、親緣關系遠的品種為雜交親本，逐漸豐富、擴寬紫色葉用萵苣的遺傳基礎，提高育種效率。

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Analysis of Genetic Diversity and Relationship in Purple Lettuce by TRAP Technique

WANG Ya-nan，HAN Ying-yan，F(xiàn)AN Shuang-xi*，BU Bin

（DepartmentofPlantScienceandTechnology，BeijingAgriculturalCollege，Beijing102206，China）

TRAP technique was used to analyze the genetic diversity and relationship of 47 purple lettuce（Lactuca sativaL. ） species．20 pairs of TRAP primers amplified polymorphic bands were 430，and the polymorphic rate was 67.08%．The genetic similarity coefficient was 0.706 3-0.982 8．The average Nei’s gene diversity index and Shannon’s information index were 0.255 3 and 0.397 6，respectively，indicating that the low degree of genetic diversity in purple lettuce．The cluster analysis divided these 47 species into 2 major groups，and the Ⅱ group could be devided into 5 subgroups．The species with similar leaf morphology were clustered together，they had closer genetic relationship．

Purple lettuce；TRAP marker；Genetic diversity

王亞楠，女，碩士研究生，專業(yè)方向：葉用萵苣種質(zhì)資源與分子標記應用，E-mail：wynxueshu369@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：范雙喜，男，教授，博士生導師，專業(yè)方向：蔬菜生理與分子機理，E-mail：fsx20@163.com

2014-02-25；接受日期：2014-04-21

國家自然科學基金項目（31372057），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系北京市葉類蔬菜創(chuàng)新團隊建設專項（blvt-02），北京市科技新星計劃項目（2010B020）