揭晶，聶淑芳，楊波，賴曉晶，劉冬琳

(武漢生物工程學(xué)院藥學(xué)院，武漢 430415)

魔芋膠(konjac glucomannan，KGM)是從天南星科(Araceae)魔芋屬多年生植物魔芋Amorphophallus rivieri中分離提純得到的一種葡甘露聚糖，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)[1]。丹皮酚除了具有抑菌抗炎[2]、解熱鎮(zhèn)痛[3]、心血管保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)[4]等作用外，還具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[5]。丹皮酚不良反應(yīng)少，半衰期短[6]，臨床治療中使用丹皮酚片(每片40 mg)要求每日3次，每次1～2片，患者感到用藥不方便，影響治療效果。丹皮酚在水中溶解度很低，性質(zhì)不穩(wěn)定，易揮發(fā)，見光易氧化分解，亦影響了它的使用和療效。本研究以丹皮酚為模型藥物，用冷凍干燥法對濕顆粒進(jìn)行干燥，采用KGM為骨架材料制備親水凝膠骨架緩釋片，利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對KGM骨架片的處方進(jìn)行了優(yōu)化。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 BS124S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);Scientz-10N冷凍干燥機(jī)(寧波市新芝生物科技股份有限公司);ZP9-5旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī)(長沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠);RC-6D溶出度測試儀(天津市新天光分析儀器技術(shù)有限公司);TU-1810紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試藥 合成丹皮酚(西安瑞迪生物科技有限公司，批號:201107，含量:98%);丹皮酚對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:110708-200206，含量:99%);魔芋膠 (湖北天源協(xié)力魔芋生物科技有限公司，40 000，30 000，20 000 mPa·s);乳糖(天津市化學(xué)試劑三廠，批號:20080124);糊精(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號:060708)。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹皮酚骨架片制備方法 稱取處方量的丹皮酚、KGM、乳糖和糊精(過篩孔內(nèi)徑0.150 mm篩)，充分混合。加入適量 70%乙醇制備軟材，過篩孔內(nèi)徑1.18 mm篩制粒，置真空冷凍干燥機(jī)中低溫干燥24 h，過篩孔內(nèi)徑1.18 mm篩整粒，再加入適量硬脂酸鎂，混合均勻，壓片，即得每片含120 mg的丹皮酚骨架片。

2.2 含量測定

2.2.1 對照品溶液的配制 稱取丹皮酚對照品1 mg，置50 mL量瓶中，用無水乙醇溶解，定容，搖勻，得濃度為 20 μg·mL－1的對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的配制 取自制丹皮酚骨架片10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于丹皮酚20 mg)置100 mL量瓶中，加無水乙醇50 mL，充分振搖使丹皮酚溶解，再用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液2 mL至50 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2.3 最大吸收波長的選擇 精密吸取上述丹皮酚對照品溶液和供試品溶液適量，以無水乙醇為空白，在波長200～500 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，丹皮酚對照品溶液和供試品溶液在波長274 nm處都有最大吸收，與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致。且按處方比例稱取輔料，同法操作，輔料在波長274 nm處無吸收。故選擇274 nm作為測定波長。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取上述丹皮酚對照品溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。以無水乙醇為空白對照，于波長274 nm處測定不同濃度對照品溶液的吸光度，并以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(C，μg·mL－1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程A=0.069C+0.016 1(r=0.999 2，n=6)。結(jié)果表明，在2.0 ～12.0 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 照“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，吸取6份，以無水乙醇為空白對照，分別在波長274 nm處測定吸光度，計(jì)算得RSD為0.86%(n=6)，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 照“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，室溫下放置，分別于 0，2，4，6，8，12，24 h 取樣，測定吸光度，考察丹皮酚供試品溶液的穩(wěn)定性。計(jì)算得RSD為1.2%(n=6)，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取丹皮酚對照品16，20，24 mg，按處方比例加入相應(yīng)的輔料，混勻，加無水乙醇50 mL，充分振搖使丹皮酚溶解，再用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液2 mL置50 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，在波長274 nm處測定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。由表1可知，該方法的平均回收率100.17%，在98%～102%之間，RSD＜1%，表明該含量測定方法符合方法學(xué)要求。

2.2.8 丹皮酚骨架片的含量測定 取3批丹皮酚骨架片，照“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別在波長274 nm處測定吸光度，并計(jì)算含量，結(jié)果分別為(100.9±1.53)%，(99.7±1.85)%，(99.9±1.71)%，符合要求。

表1 丹皮酚回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery test of paeonol

2.3 丹皮酚骨架片處方篩選

2.3.1 體外釋放度測定方法 照《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄ⅩD釋放度測定法[8]，采用轉(zhuǎn)籃法，以雙蒸水為釋放介質(zhì)，測定體外釋放度。取本品6片，分別投入6個轉(zhuǎn)籃內(nèi)，加入釋放介質(zhì)900 mL，轉(zhuǎn)速 100 r·min－1，溫度(37.0 ± 0.5)℃，于 2，4，6，8，10，12 h分別取樣6 mL(補(bǔ)充同溫同體積的雙蒸水溶液)。樣品用微孔濾膜0.45 μm濾過，在274 nm處測定吸光度。根據(jù)測定的吸光度值，計(jì)算出其累積釋放度，并繪制釋放曲線。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在前期單因素考察的基礎(chǔ)上確定了進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)的影響因素及水平，選擇對藥物釋放影響較大的3個因素，即KGM的黏度(A)、KGM的用量(B)和乳糖的用量(C)，每個因素分別取3個水平，以糊精為填充劑使片質(zhì)量保持300 mg。根據(jù)L9(34)正交表確定處方組成，按照制備工藝制備凝膠骨架片。正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平見表2。

表2 因素水平表Tab.2 Factors and levels

照《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄ⅪⅩD 緩釋制劑指導(dǎo)原則[8]，采用綜合評分法，選擇 2，6，12 h 3個時間點(diǎn)的體外累積釋放度(Q)作為考察指標(biāo)，先測定不同處方2，6，12 h的釋放率，再代入公式后得出總分，最后用直觀分析法和方差分析法，對計(jì)算結(jié)果進(jìn)行分析。Y(綜合評分值)的計(jì)算公式為:Y=Q12－[(Q2－20)2+(Q6－50)2]1/2。其中，(Q2－20)2+(Q6－50)2反映了2，6 h釋放度的偏差，此偏差越小越符合緩釋制劑釋放要求;Q12值則越大越符合緩釋制劑釋放要求。并對Y值進(jìn)行分析處理，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

由表3極差可知，各因素對丹皮酚骨架片釋放度的影響順序?yàn)锳＞C＞B，即KGM的黏度＞乳糖的用量＞KGM的用量。同時表4結(jié)果表明，KGM的黏度對丹皮酚骨架片釋放度的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而KGM和乳糖的用量水平內(nèi)對釋放度的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各因素的最佳組合為A1B3C1，即KGM的黏度為20 000 mPa·s，KGM 的用量為30%，乳糖的用量為20%。

表3 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of orthogonal experiment

表4 方差分析(α=0.05)Tab.4 Analysis of variance(α=0.05)

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)抽取按優(yōu)化處方實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備的3批丹皮酚骨架片，色澤均勻，光滑，無粘沖，無雜斑，無異物。依法測定Q值，結(jié)果制備的骨架片在第2，6，12 h的 Q 值分別為(23.65±1.14)%，(65.97±1.37)%，(91.94±1.35)%。3批骨架片的體外Q-t曲線見圖1。

根據(jù)最佳工藝制得的 3 批骨架片在 0.5，1，2，4，6，8，10，12 h 的 Q 值平均值分別為 10.98%，13.85%，23.65%，43.30%，65.97%，76.76%，88.60%，91.94%。對其進(jìn)行 Higuchi方程擬合，得方程Q(%)=32.441t1/2－17.159(r=0.992 7)，可見其釋放數(shù)據(jù)能夠使用Higuchi方程較好地?cái)M合。

圖1 3批樣品體外釋藥曲線Fig.1 In vitro drug release curves of three batches of samples

3 討論

前期單因素實(shí)驗(yàn)還考察了丹皮酚的粒度對骨架片體外釋放的影響，結(jié)果表明丹皮酚粒度越大，釋藥越慢，這和丹皮酚在水中溶解度較小有關(guān)，所以選擇通過篩孔內(nèi)徑0.150 mm篩的丹皮酚。

采用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行處方優(yōu)化的結(jié)果表明，KGM的黏度對骨架片的體外釋放影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。選用黏度為20 000 mPa·s，含量30%的KGM制備丹皮酚骨架片，制備工藝易于控制，緩釋效果較為突出。優(yōu)化工藝制得的丹皮酚骨架片工藝簡單，體外釋放的累積釋放度與時間的關(guān)系符合Higuchi方程。

本研究制備的丹皮酚骨架片，可在體外持續(xù)釋放12 h，減少給藥次數(shù)，提高患者的順應(yīng)性。魔芋膠作為親水凝膠骨架材料，具有較好的緩釋特性，是一種極有發(fā)展?jié)摿Φ男滦洼o料。藥物與載體材料間的相互作用及魔芋膠-丹皮酚的緩釋機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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