劉雪飛，張 旭，林 江

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院口腔科，黑龍江哈爾濱150001)

牙槽骨吸收是牙周炎的典型病理性改變，也是判定患牙預(yù)后的重要依據(jù)［1］。牙槽骨吸收包括牙槽骨體積減小和牙槽骨密度的降低，雖可通過組織病理形態(tài)學(xué)計(jì)量法對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，并一直被視為是評(píng)估骨吸收的金標(biāo)準(zhǔn)［2］;但組織病理切片制作耗時(shí)耗力［3］，不僅破壞樣本，而且標(biāo)本易變形，難以保證切面測(cè)量位點(diǎn)的準(zhǔn)確性［4］，更無法測(cè)量三維(three-dimensional，3-D)體積，從而影響了評(píng)估的準(zhǔn)確性。而骨密度的測(cè)定主要是通過X線片光密度法或各種骨密度儀，其所獲得的數(shù)值雖能在一定程度上代表骨密度，但不能反映骨微結(jié)構(gòu)的密度改變［5］。近年來高分辨率的微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(Micro-CT)作為一種無損檢測(cè)手段，因其圖像三維重建功能可清晰顯示骨組織的立體結(jié)構(gòu)，并能通過精確測(cè)量各骨小梁參數(shù)而真實(shí)反映骨微結(jié)構(gòu)的性質(zhì)［6］，近年來已逐漸在醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域中廣泛用于對(duì)骨組織的評(píng)估。但是牙槽骨疏松多孔，當(dāng)發(fā)生骨破壞時(shí)則呈現(xiàn)出非均一性，并且在影像學(xué)圖像中，牙槽骨的密度與牙根組織的密度比較接近，計(jì)算機(jī)很難自動(dòng)識(shí)別和分割;因此僅通過Micro-CT圖像的常規(guī)分析難以準(zhǔn)確三維定量分析牙槽骨的骨量，所以現(xiàn)大多數(shù)研究只限于進(jìn)行定性診斷和兩維定量評(píng)估。本研究運(yùn)用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)中的對(duì)偶運(yùn)算，對(duì)Micro-CT圖像進(jìn)行腐蝕-膨脹(Erode-Dilate)處理，使之快速、準(zhǔn)確將牙體組織與牙槽骨組織進(jìn)行識(shí)別和無損性分割;然后再結(jié)合MedCAD模塊中的球形(Sphere)三維分析法，定量分析小鼠第二磨牙(the second molar，M2)周圍剩余骨量。

1 材料和方法

1.1 建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型

取8周齡健康C57雌性小鼠(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)20只，體質(zhì)量(20±1)g，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(n=10)。實(shí)驗(yàn)組參照Lin［7］報(bào)道的方法，用5-0絲線結(jié)扎各小鼠的雙側(cè)上頜第二磨牙(the second molar，M2)牙頸部，并將絲線置于齦溝內(nèi)建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型;對(duì)照組不作任何處理，置于實(shí)驗(yàn)組同樣飼養(yǎng)環(huán)境［溫度(23±1)℃，相對(duì)濕度(60±5)%］，12 h晝夜循環(huán)照明下進(jìn)行飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。2周后實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型建立成功，分別處死所有大鼠并取其上頜骨，用于進(jìn)行Micro-CT掃描。

1.2 Micro-CT掃描

分別將各小鼠的上頜骨標(biāo)本置于 Micro-CT系統(tǒng)的檢測(cè)試管內(nèi)，以空氣為介質(zhì)，應(yīng)用分辨率為1 024×1 024 的 μCT40(Scanco Medical，瑞士)進(jìn)行掃描。掃描時(shí)保持牙長(zhǎng)軸與掃描平面垂直，掃描參數(shù):360°旋轉(zhuǎn)，管電壓 70 kV，管電流 114 μA，整合時(shí)間300 ms，像素點(diǎn)尺寸12 μm ×12 μm，層間距12 μm。掃描結(jié)束后，通過三維重建獲得 DICOM格式待分析圖像。

1.3 Micro-CT圖像分析方法

1.3.1 二維線性分析

調(diào)整所有圖像使第一磨牙(M1)、第二磨牙(M2)、第三磨牙(M3)的釉牙骨質(zhì)界(cementalenamelo junction，CEJ)與根尖孔(root apex，RA)處在同一矢狀水平的二維(two-dimensional，2-D)切片上，然后應(yīng)用Mimics 16.0軟件進(jìn)行2-D線性分析。通過線性分析(圖1)分別測(cè)量出M1-M2或M2-M3之間 CEJ到牙槽骨嵴頂(alveolar bone crest，ABC)的距離，以及CEJ到RA之間的根長(zhǎng)度(RLs，以mm為單位);然后按照表1中所列的公式1、2［8］，計(jì)算出各自用以評(píng)估矢狀面余留骨量的百分比。

1.3.2 三維體積分析

應(yīng)用Mimics 16.0軟件獲取各組各動(dòng)物包含牙槽骨及牙齒的Micro-CT圖像，并在Micro-CT圖像中分別測(cè)量各動(dòng)物的M2根分叉到M1遠(yuǎn)中頰根RA的距離。然后再運(yùn)用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的Erode-Dilate進(jìn)行相關(guān)運(yùn)算:①通過對(duì)圖像進(jìn)行Erode運(yùn)算，以消除牙齒與牙槽骨圖像的邊界點(diǎn)，并使邊界向內(nèi)部收縮;②運(yùn)用區(qū)域生長(zhǎng)算法，將具有相似性的像素集合起來，從而選中牙齒圖像;③先運(yùn)用波爾運(yùn)算獲得Erode后的獨(dú)立牙槽骨圖像，然后再運(yùn)用Dilate算法對(duì)牙槽骨圖像進(jìn)行膨脹處理使之恢復(fù)到原始像素水平，從而將牙齒圖像(圖2綠色部分)與牙槽骨圖像(圖2紫色部分)無損性的完全分離，并同時(shí)將牙齒圖像進(jìn)行3-D化而得到牙齒的3-D圖像(圖2青色部分)。上述計(jì)算結(jié)束后，用MedCAD模塊中的球形(Sphere)確定ROI(圖2):以先前計(jì)算得到的M2根分叉到M1遠(yuǎn)中頰根RA的距離(平均值)作為Sphere的半徑r，并將Sphere的中心調(diào)整至M2的根分叉處;然后將2-D的Sphere 3-D化(圖2紅色部分)，最后再將ROI及ROI內(nèi)的牙槽骨圖像進(jìn)行3-D化，此時(shí)軟件會(huì)自動(dòng)生成ROI的總體積(Total volume，TV)、ROI內(nèi)牙槽骨(圖2藍(lán)色部分)的骨小梁體積(Trabecular bone volume，BV)、骨表面積(Trabecular bone surface，BS);所得數(shù)據(jù)即可按表1中的公式3、4、5、6［9］分別計(jì)算出 ROI內(nèi)牙槽骨的骨體積分?jǐn)?shù)(Bone Volume Fraction，BVF)、骨小梁數(shù)目(Trabecular Number，Tb.N)、骨小梁厚度(Trabecular Thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度(Trabecular Separation，Tb.Sp)等骨微參數(shù)(表2)。

表1 各種分析方法的計(jì)算公式

圖1 Micro-CT圖像2-D線性分析

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間各相應(yīng)數(shù)據(jù)()的比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。并同時(shí)對(duì)不同檢測(cè)者采用兩種方法分析的結(jié)果進(jìn)行可靠性和可重復(fù)性的相關(guān)性分析，分別分析其組內(nèi)、組間的相關(guān)系數(shù)(ICC)和變異系數(shù)(CV)。其中ICC值為0～1，越接近于1，可靠性越強(qiáng);＞0.75時(shí)，即表示具有良好的可靠性［10］。變異系數(shù)［CV(%)=SD/其平均值×100%］作為精度誤差可描述測(cè)量的可重復(fù)性［11］，從而能檢驗(yàn)檢測(cè)者的組內(nèi)和組間變異。

2 結(jié)果

2-D線性分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組牙槽骨余留量少于對(duì)照組(P＜0.05)(圖3)。

3-D體積分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的BV/TV、Tb.N、Tb.Th各骨微參數(shù)均小于對(duì)照組(P＜0.05)(圖4a～c);而Tb.Sp的分析結(jié)果則是實(shí)驗(yàn)組明顯大于對(duì)照組(P＜0.05)(圖4d)。

對(duì)不同檢測(cè)者采用兩種方法分析的結(jié)果進(jìn)行可靠性和可重復(fù)性分析顯示，2-D分析方法時(shí)檢測(cè)者的組內(nèi)變異為:ICC值均＞0.75、CV值均＞1.5%;組間變異為:ICC值＜0.75、CV值＞1.5%，可靠性與可重復(fù)性相對(duì)較差;而采用3-D分析方法時(shí)檢測(cè)者的組內(nèi)變異和組間變異均為ICC值均＞0.75、CV值均＜1.5%，可靠性與可重復(fù)性均很好(表2)。

對(duì)同一檢測(cè)者采用兩種方法所需的檢測(cè)時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示，3-D分析方法所需的檢測(cè)時(shí)間明顯少于2-D分析方法(圖5)。

表2 檢測(cè)者之間相關(guān)性檢測(cè)

圖4 3-D體積分析比較各組的骨微參數(shù)(*P＜0.05)

圖5 2-D線性距離分析與3-D體積分析用時(shí)比較(*P＜0.05)

3 討論

牙周炎中牙槽骨的吸收呈現(xiàn)連續(xù)性的非均一性，作為其檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的組織病理切片因有時(shí)切不到牙槽骨吸收的位置，所以不能真正體現(xiàn)不規(guī)則的牙槽骨吸收情況，也不能實(shí)時(shí)的反映牙槽骨量的變化。而Micro-CT可以在不破壞樣品的情況下，對(duì)骨骼、牙齒、生物材料等離體樣本和活體小動(dòng)物進(jìn)行高分辨率(幾十微米到亞微米級(jí))的X射線成像，從而獲得樣品內(nèi)部詳盡的三維結(jié)構(gòu)信息［12］。利用Micro-CT圖像可檢驗(yàn)的參數(shù)包括:BVF、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N 等［13］，其中 BVF 是指礦化的骨組織所占總體積的比例;Tb.Th用來比較骨小梁的粗細(xì)程度;Tb.Sp可反映骨小梁之間間隙的寬窄水平;Tb.N可反映骨小梁連接的緊密度。以上這些參數(shù)均可在骨微結(jié)構(gòu)上反映牙槽骨的變化。

有研究［14-20］表明，Micro-CT的2-D 形態(tài)學(xué)測(cè)量與傳統(tǒng)的組織病理的骨形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果具有高度相關(guān)性，是一種可以取代普通組織病理切片的新方法［9］，所以本實(shí)驗(yàn)選擇2-D線性分析作為趨勢(shì)對(duì)比。但是應(yīng)用Micro-CT圖像進(jìn)行2-D分析的研究［21-26］無法觀察牙槽骨在空間各個(gè)方向上的變化以及骨組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)，更無法評(píng)估骨組織三維體積的變化，顯然會(huì)降低測(cè)量的準(zhǔn)確度和敏感度。Micro-CT中對(duì)骨量的三維定量分析需要通過密度識(shí)別而準(zhǔn)確分割目標(biāo)組織，但是由于牙槽骨與牙根組織的密度在影像學(xué)圖像上很接近，計(jì)算機(jī)不能準(zhǔn)確的自動(dòng)識(shí)別，從而限制了Micro-CT對(duì)牙槽骨定量分析的應(yīng)用。雖然也有很多學(xué)者試圖通過不同的標(biāo)志點(diǎn)或者平面水平，選取各自不同的ROI對(duì)牙槽骨的Micro-CT圖像進(jìn)行了3-D分析［27-30］，從而進(jìn)行吸收量的評(píng)估，如密歇根大學(xué)的Park等通過手動(dòng)的方法描繪Micro-CT各個(gè)2-D圖像上的牙槽骨邊界，從而達(dá)到牙槽骨與牙齒分離的效果，然后再進(jìn)行3-D骨微參數(shù)的計(jì)算，并進(jìn)行余留牙槽骨的三維定量評(píng)估［8］。但這些方法在分析和操作的過程均過于繁瑣，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大。所以，怎樣將牙根及其周圍的牙槽骨進(jìn)行有效的快速分離，始終是阻礙開展應(yīng)用Micro-CT定量評(píng)估牙槽骨的瓶頸問題;另外在Mircro-CT圖像上，以往研究也無理想的解剖定位標(biāo)準(zhǔn)，從而導(dǎo)致了數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性較差，難以作多樣本圖像之間的準(zhǔn)確比較，以上這些就是本研究著力解決的問題。

本研究中運(yùn)用了數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)中的運(yùn)算:腐蝕(Erode)和膨脹(Dilate)，其基礎(chǔ)是集合論，即在圖像的處理中將其所有的像素點(diǎn)當(dāng)作一個(gè)集合，然后通過結(jié)構(gòu)元素來對(duì)圖像進(jìn)行探查，并對(duì)具有一定形態(tài)的結(jié)構(gòu)元進(jìn)行測(cè)量和提取圖像中的對(duì)應(yīng)形狀，以達(dá)到對(duì)圖像分析和識(shí)別的目的［31-32］?；谶@一理論，運(yùn)用Erode-Dilate運(yùn)算可以優(yōu)化圖像數(shù)據(jù)、保持它們基本的形狀特性、排除不相干的結(jié)構(gòu)，并能實(shí)現(xiàn)對(duì)圖像的邊緣檢測(cè)、特征提取和圖像分割，從而達(dá)到準(zhǔn)確、快速，且無損性的分離出牙齒與牙槽骨的目的。同時(shí)使用MedCAD模塊中的Sphere，特異的選取了根分叉、根尖孔等解剖標(biāo)志點(diǎn)作為定位點(diǎn)對(duì)ROI進(jìn)行選取，使之包含全部的牙周病損部位。結(jié)果證實(shí)，該方法具有極高的可重復(fù)性，不僅實(shí)現(xiàn)了定位準(zhǔn)確的目的，還更便于相關(guān)分析人員的辨認(rèn)和操作。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，Erode-Dilate結(jié)合MedCAD模塊中的Sphere 3-D分析的結(jié)果與2-D分析比較趨勢(shì)一致，并證實(shí)通過絲線結(jié)扎可導(dǎo)致小鼠的牙槽骨吸收。Erode-Dilate結(jié)合MedCAD模塊中的Sphere 3-D分析的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的余留牙槽骨量Tb.N、Tb.Th均較對(duì)照組明顯降低，而Tb.Sp則較對(duì)照組明顯升高。以上結(jié)果不僅從骨微結(jié)構(gòu)上證明了實(shí)驗(yàn)組的牙槽骨密度明顯降低，同時(shí)也表明了Erode-Dilate結(jié)合MedCAD模塊中的Sphere 3-D分析法與2-D測(cè)量相比，在對(duì)牙槽骨吸收的評(píng)估中具有更高的靈敏性;并且該方法的離散程度小，靈敏度高，包含的骨評(píng)價(jià)指標(biāo)更多，可靠性好。對(duì)兩種分析方法所需的檢測(cè)時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析也表明，Erode-Dilate結(jié)合MedCAD模塊中的Sphere 3-D分析法與2-D分析法相比，具有高效、省時(shí)的特點(diǎn)。

綜上所述，Erode-Dilate結(jié)合MedCAD模塊中的Sphere 3-D分析法可有效的評(píng)估牙槽骨量，是一種非常實(shí)用的Micro-CT圖像分析方法，有望未來將其應(yīng)用于臨床進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的牙周炎診斷和療效評(píng)估。

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