冬蟲(chóng)夏草與蛹蟲(chóng)草融合株的原生質(zhì)體誘變育種

曲鴻雁，郭成金*

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

冬蟲(chóng)夏草與蛹蟲(chóng)草融合株的原生質(zhì)體誘變育種

曲鴻雁，郭成金*

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

以冬蟲(chóng)夏草與蛹蟲(chóng)草融合株為研究材料，對(duì)其原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變，篩選優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的新型菌株。得到了高產(chǎn)菌株Y-90，蟲(chóng)草酸產(chǎn)量是出發(fā)菌株的1.80 倍，高產(chǎn)菌株YP-42，蟲(chóng)草素產(chǎn)量是出發(fā)菌株的1.33 倍。采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplifi ed polymorphic DNA，RAPD）分子標(biāo)記技術(shù)和核糖體rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列分析技術(shù)對(duì)突變株的遺傳變異情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明突變株的ITS序列并沒(méi)有發(fā)生變化。RAPD結(jié)果顯示突變株的擴(kuò)增片段與親本菌株不同，說(shuō)明發(fā)生了基因突變，其高產(chǎn)性狀是可遺傳的性狀，可以將其用于進(jìn)一步的育種研究。

冬蟲(chóng)夏草；蛹蟲(chóng)草；紫外誘變；蟲(chóng)草酸；蟲(chóng)草素；子實(shí)體；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA；rDNA-ITS

冬蟲(chóng)夏草和蛹蟲(chóng)草是我國(guó)常見(jiàn)的藥用價(jià)值較高的兩種蟲(chóng)草菌[1]。蛹蟲(chóng)草現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化栽培[2]，而目前冬蟲(chóng)夏草人工培養(yǎng)研究主要在兩方面，一是人工模擬冬蟲(chóng)夏草生境條件進(jìn)行的培養(yǎng)，二是菌絲體液體深層發(fā)酵培養(yǎng)提取有益成分[3-5]。在冬蟲(chóng)夏草和蛹蟲(chóng)草中，蟲(chóng)草酸（D-甘露醇）和蟲(chóng)草素（3’-脫氧腺苷）是最具有代表性的有益成分，是測(cè)定蟲(chóng)草品質(zhì)的重要分析測(cè)試指標(biāo)[6-7]。冬蟲(chóng)夏草與蛹蟲(chóng)草融合株是天津師范大學(xué)蕈菌研究所利用滅活原生質(zhì)體融合法選育出來(lái)的菌株，通過(guò)生長(zhǎng)速率測(cè)定，頡頏實(shí)驗(yàn)以及分子標(biāo)記技術(shù)初步確定為冬蟲(chóng)夏草與蛹蟲(chóng)草融合而成[8]。本實(shí)驗(yàn)以其為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變研究，以蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素產(chǎn)量和子實(shí)體生長(zhǎng)情況為指標(biāo)篩選優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的新菌株，為細(xì)胞育種選育更高食藥用價(jià)值的菌株，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；耘嗵峁├碚摵蛯?shí)踐支持。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與培養(yǎng)基

冬蟲(chóng)夏草[Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.]與蛹蟲(chóng)草[Cordyceps militaris（L. ex Fr.）Link.]融合株，由天津師范大學(xué)蕈菌研究所提供。

溶壁酶、纖維素酶R-10、蝸牛酶PB11010 北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司；甘露醇（蟲(chóng)草酸）標(biāo)準(zhǔn)品（超級(jí)純）、蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 北京索萊寶科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chainreaction，PCR）擴(kuò)增所用試劑 日本TaKaRa公司；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA PCR引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；核糖體rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列PCR引物Invitrogen（北京）貿(mào)易有限公司。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖5.00 g、蔗糖5.00 g、酵母粉2.50 g、黃豆粉5.00 g（浸提液）、KH2PO41.50 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、VB14 mg、蒸餾水1 000 mL，pH值自然[9]。

再生培養(yǎng)基：葡萄糖5.25 g、蔗糖5.25 g、蛋白胨1.13 g、酵母粉1.57 g、KH2PO40.63 g、MgSO4·7H2O 0.31 g、VB14 mg、瓊脂8.00 g、0.60 mol甘露醇為滲穩(wěn)劑，蒸餾水1 000 mL。

栽培培養(yǎng)基：每瓶大米10.00 g、小麥30.00 g、營(yíng)養(yǎng)液80 mL；營(yíng)養(yǎng)液的成分為：KH2PO42.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、VB14 mg，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

1.2儀器與設(shè)備

TGL-16高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-2550微量紫外分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；WD700微波爐 天津樂(lè)金電子電器有限公司；DYY-5電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplifi ed polymorphic DNA，RAPD）反應(yīng)引物與體系

參考引物對(duì)蟲(chóng)草菌株的擴(kuò)增效果，選用以下重復(fù)性高，穩(wěn)定性好的12 種隨機(jī)引物，其引物編號(hào)、核酸序列、退火溫度見(jiàn)表1，反應(yīng)體系為：10×Buffer（Mg2+plus） 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2.0 μL，5 U/μL Taq DNA酶0.5 μL，20 μmol/L 隨機(jī)引物1.0 μL，200 ng/μL模板DNA 2.0 μL，ddH2O 17.0 μL，反應(yīng)總體積為25 μL。

表1　RAPD供試引物編號(hào)及序列Table1Primers and their sequences used for RAPDRAPD

1.4核糖體RNA基因（rDNA）轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列反應(yīng)引物與體系

rDNA-ITS分析所用的ITS1和ITS4引物[10-11]序列：ITS1 5'-TCCGT AGGTG AACCT GCGG-3'，ITS4 5'-TCCTC CGCTT ATTGA TATGC-3'，反應(yīng)體系為：10×Buffer 3.0 μL，10 mmol/L dNTPs 2.0 μL，5 U/μL Taq DNA酶0.4 μL，10 μmol/L ITS1/ITS4引物各1.0 μL，200 ng/μL模板DNA 1.0 μL，ddH2O 21.6 μL，反應(yīng)總體積為30 μL。

1.5方法

1.5.1原生質(zhì)體的紫外誘變

將動(dòng)靜相間法培養(yǎng)3 d的融合株菌絲體[9]，以0.6 mol/L MgSO4·7H2O為滲穩(wěn)劑，在質(zhì)量濃度為1 g/100 mL蝸牛酶與1 g/100 mL纖維素酶作用下，27 ℃酶解2 h制備原生質(zhì)體，將制備好的原生質(zhì)體稀釋至102個(gè)/mL，取200 μL涂布于再生培養(yǎng)基，每個(gè)時(shí)間取3 個(gè)重復(fù)，同時(shí)涂布3 個(gè)對(duì)照平板，將涂布好的平板置于黑箱中，15 W紫外燈管提前30 min預(yù)熱，平板與紫外燈垂直距離為30 cm，分別照射0、30、60、90、120、150 s，誘變后將平板用報(bào)紙包好，注意避光，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，計(jì)算不同誘變時(shí)間的原生質(zhì)體再生率和致死率，確定最佳紫外誘變條件。

1.5.2突變菌株的篩選

在最佳紫外誘變條件下處理原生質(zhì)體，待原生質(zhì)體的再生菌落長(zhǎng)出后，挑取優(yōu)先再生出來(lái)、菌落直徑大、菌絲體生長(zhǎng)旺盛的單菌落，接種到培養(yǎng)皿中，進(jìn)行突變菌株的初篩。將初篩中篩選出的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，25 ℃培養(yǎng)6 d，動(dòng)靜相間法培養(yǎng)得菌絲體用于接種栽培培養(yǎng)基，進(jìn)行出草培養(yǎng)[12-14]；磁力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)得菌絲體，經(jīng)抽濾后置于60 ℃烘箱中8 h烘干，用研缽研成粉末狀，過(guò)65 目篩，制成菌絲體粉末樣品，采用微波提取法[15-17]，以高碘酸鉀比色法測(cè)定蟲(chóng)草酸產(chǎn)量，紫外分光光度法測(cè)定蟲(chóng)草素產(chǎn)量，并與親本進(jìn)行比較和篩選，從而獲得優(yōu)勢(shì)突變菌株。

1.5.3蟲(chóng)草酸產(chǎn)量測(cè)定[18-19]

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精密稱取甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g，加蒸餾水50 mL，配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的甘露醇溶液，分別精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL各置100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50、60 μg/mL的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照文獻(xiàn)[18]中的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液的配制：稱取蟲(chóng)草菌絲體粉末0.1000 g，放入錐形瓶中，加25 mL蒸餾水，輕輕搖勻，每個(gè)樣品瓶配5 瓶盛有25 mL蒸餾水的空白瓶，在微波爐中圍繞圓盤中心均勻排成1 圈，保證每瓶接受的微波劑量相同，中火處理2 min，冷水冷卻，25 mL容量瓶定容，從中取5 mL，加蒸餾水定容至25 mL，即得質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的樣品溶液。

分別取不同誘變時(shí)間的蟲(chóng)草樣品溶液1 mL，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法操作，測(cè)定其吸光度，帶入回歸方程，計(jì)算樣品溶液中甘露醇產(chǎn)量，再通過(guò)公式，計(jì)算樣品中蟲(chóng)草酸的產(chǎn)量。

1.5.4蟲(chóng)草素產(chǎn)量測(cè)定[20]

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精密稱取0.005 g蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙醇溶解，50 mL容量瓶定容，制備成0.1 mg/mL的蟲(chóng)草素母液。分別配制1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/mL的蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。紫外分光光度計(jì)全波段掃描蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品，在260 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，以70%乙醇代替蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對(duì)照，分別測(cè)定其吸光度。以蟲(chóng)草素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液的配制：稱取蟲(chóng)草菌絲體粉末0.1000 g，放入錐形瓶中，加入70%的乙醇25 mL，輕輕搖勻，每個(gè)樣品瓶配5 瓶盛有25 mL蒸餾水的空白瓶，在微波爐中圍繞圓盤中心均勻排成1 圈，低火處理1 min，冷水冷卻，從中取2 mL于離心管中，加入70%乙醇2 mL，即得質(zhì)量濃度為2 mg/mL的樣品溶液。將提取好的樣品在260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，帶入回歸方程，計(jì)算樣品溶液中蟲(chóng)草素產(chǎn)量，再通過(guò)公式，計(jì)算樣品中蟲(chóng)草素的產(chǎn)量。

1.5.5RAPD-PCR分析

參照SDS-EDTA法[8]提取突變菌株、融合株、冬蟲(chóng)夏草和蛹蟲(chóng)草的基因組DNA，采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA濃度和純度的檢測(cè)，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，36.9 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃補(bǔ)平5 min，終止溫度為4 ℃。使用表1中的12 個(gè)隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD分析。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中分子質(zhì)量不同的DNA條帶視為多態(tài)性狀，根據(jù)電泳結(jié)果記錄清晰可重復(fù)條帶。記錄標(biāo)準(zhǔn)為在同一遷移率上，擴(kuò)增陽(yáng)性賦值為1，陰性賦值為0，分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)建立特征數(shù)值矩陣。使用NTSYS-pc 2.10e軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用非加權(quán)組平均法（unweighted pairgroup method with arithmetic means，UPGMA）法進(jìn)行聚類分析，通過(guò)Tree plot程序生成聚類圖[21]。

1.5.6ITS-PCR分析

ITS-PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共39 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃補(bǔ)平5 min，終止溫度為4 ℃。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，PCR引物為測(cè)序引物，交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

通過(guò)MEGA4.0軟件對(duì)測(cè)得的ITS序列進(jìn)行編輯校正后，提交美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站，在GenBank（基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)）中與已發(fā)表的ITS序列進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)，搜索并篩選與其相似度較高的序列。從GenBank中調(diào)取蟲(chóng)草屬[Cordyceps（Fr.）Link.]相關(guān)序列，基于Kimura 2-Parameter Distance方法計(jì)算突變株與各蟲(chóng)草菌株的rDNA ITS序列的遺傳距離。

2　結(jié)果與分析

2.1紫外誘變效應(yīng)曲線及誘變劑量

圖1　融合株原生質(zhì)體紫外誘變劑量效應(yīng)曲線Fig.1UV-dose response curve for fusant protoplast

融合株原生質(zhì)體紫外誘變劑量效應(yīng)曲線如圖1，原生質(zhì)體對(duì)紫外線很敏感，經(jīng)紫外線照射后致死率隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在0～90 s照射時(shí)間內(nèi)，曲線變化劇烈，致死率達(dá)到80%左右，120 s后，曲線趨于平緩，逐漸達(dá)到90%以上。本實(shí)驗(yàn)選用90 s紫外照射時(shí)間，該劑量下的致死率為81.82%，較易獲得理想的正突變菌株[18]。2.2 蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素產(chǎn)量與出草情況

由比色法測(cè)定蟲(chóng)草酸和蟲(chóng)草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以甘露醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL），412 nm波長(zhǎng)處吸光度為縱坐標(biāo)（y），得到蟲(chóng)草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.010 8x-0.021 5，曲線回歸系數(shù)（R2）達(dá)到1；以蟲(chóng)草素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL），260 nm波長(zhǎng)處吸光度為縱坐標(biāo)（y），得到蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.040 7x-0.003 2，曲線回歸系數(shù)（R2）達(dá)到0.999 7，具有較好的線性關(guān)系。

以90 s為紫外誘變照射時(shí)間，將融合株原生質(zhì)體分別照射10 批，每批稀釋后涂布再生培養(yǎng)基，共分離得到快速再生的菌落179 株，根據(jù)生長(zhǎng)速率和菌絲體粗壯程度與出發(fā)菌株的比較，從中篩選到10 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株，并將其進(jìn)行出草培養(yǎng)，通過(guò)液體培養(yǎng)收集菌絲體，烘干研碎后測(cè)定其蟲(chóng)草酸和蟲(chóng)草素的產(chǎn)量，并與親本進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2突變株與親本中蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素產(chǎn)量及出草情況比較（n=3）=3Table2Comparison of cordycepic acid，cordycepin and fruit-body yields between parent and mutant strains（insn=3）=3

由表2蟲(chóng)草酸產(chǎn)量可知，親本中冬蟲(chóng)夏草蟲(chóng)草酸產(chǎn)量最高，蛹蟲(chóng)草最低，蟲(chóng)草融合株介于兩者之間；10 株紫外誘變菌株中，有5 株蟲(chóng)草酸產(chǎn)量高于冬蟲(chóng)夏草，其中誘變株Y-90產(chǎn)量最高，為134.87 mg/g，是出發(fā)菌株（蟲(chóng)草融合株）的1.80 倍，所以最終確定Y-90為蟲(chóng)草酸產(chǎn)量的優(yōu)勢(shì)突變菌株。

由表2蟲(chóng)草素產(chǎn)量測(cè)定情況可知，親本中蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素產(chǎn)量最高，冬蟲(chóng)夏草最低，蟲(chóng)草融合株介于兩者之間；10 株紫外誘變菌株中，蟲(chóng)草素產(chǎn)量較融合株有一定的提高，但均沒(méi)有超過(guò)蛹蟲(chóng)草；其中誘變株YP-42與其他誘變株相比蟲(chóng)草素產(chǎn)量最高，為5.45 mg/g，是出發(fā)菌株（蟲(chóng)草融合株）的1.33 倍，所以最終確定YP-42為蟲(chóng)草素產(chǎn)量的優(yōu)勢(shì)突變菌株。

表3蟲(chóng)草酸產(chǎn)量的方差分析Table3Variance analysis of cordycepic acid yieldTable3Variance analysis of cordycepic acid yield

表4　蟲(chóng)草素產(chǎn)量的方差分析Table4Variance analysis of cordycepin yieldyield

采用SPSS軟件對(duì)菌株間蟲(chóng)草酸與蟲(chóng)草素產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明冬蟲(chóng)夏草、蛹蟲(chóng)草、融合株與突變株Y-90、YP-42的蟲(chóng)草酸產(chǎn)量分別為：（85.20±0.59）、（40.18±0.35）、（74.79±0.24）、（134.87±0.56）、（72.43±0.18）mg/g。方差分析如表3，F(xiàn)值為20 095.401，大于F0.01（4,10）=5.994[22]，表明不同菌株間蟲(chóng)草酸產(chǎn)量差異顯著（P＜0.01）。冬蟲(chóng)夏草、蛹蟲(chóng)草、融合株與突變株Y-90、YP-42的蟲(chóng)草素產(chǎn)量分別為：（3.98±0.01）、（10.96±0.06）、（4.09±0.04）、（4.85±0.02）、（5.45±0.03）mg/g對(duì)菌株間蟲(chóng)草素產(chǎn)量進(jìn)行方差分析如表4，F(xiàn)值為22 270.109，大于F0.01（4,10）=5.994[22]，表明不同菌株間蟲(chóng)草素產(chǎn)量差異顯著（P＜0.01）。

圖2部分菌株的出草情況Fig.2Sporocarp culture of some strains

部分菌株的出草情況如圖2，除親本蛹蟲(chóng)草可以出草外，其他菌株均未見(jiàn)形成原基和子實(shí)體；蛹蟲(chóng)草菌絲體在光照后開(kāi)始轉(zhuǎn)色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)顏色逐漸加深，隨后可形成原基，并逐漸生長(zhǎng)形成幼嫩的子實(shí)體（圖2a、2b），冬蟲(chóng)夏草和融合株菌絲體為雪白色，無(wú)原基出現(xiàn)（圖2c、2d）；突變菌株的菌絲體與冬蟲(chóng)夏草和融合株相同，均未見(jiàn)轉(zhuǎn)色，突變株Y-90和YP-42的出草培養(yǎng)情況分別為圖2e、2f。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)冬蟲(chóng)夏草與蛹蟲(chóng)草融合株的原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變，預(yù)期得到優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)并可以形成子實(shí)體的突變株，本結(jié)果與預(yù)期目標(biāo)有一定的差異。首先，融合株與突變株的菌絲體在光照條件下均未見(jiàn)轉(zhuǎn)色，未見(jiàn)形成原基和子實(shí)體；其次，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中并未篩選到蟲(chóng)草素產(chǎn)量較蛹蟲(chóng)草高的突變株，融合株與突變株主要表現(xiàn)的是冬蟲(chóng)夏草的性狀。分析原因是蟲(chóng)草融合株是經(jīng)紫外滅活的蛹蟲(chóng)草原生質(zhì)體，與經(jīng)熱滅活的冬蟲(chóng)夏草原生質(zhì)體融合而得[8]，而在雙親原生質(zhì)體融合過(guò)程中，兩個(gè)菌株的遺傳物質(zhì)發(fā)生了不同程度的變化，使得蛹蟲(chóng)草的某些遺傳物質(zhì)在基因重組后并未在融合株中表達(dá)出來(lái)。蟲(chóng)草素最初是從蛹蟲(chóng)草中提取分離出來(lái)的抗菌素，是蛹蟲(chóng)草的有效成分之一[23]，天然冬蟲(chóng)夏草中產(chǎn)量較少[24]，而以融合株為出發(fā)菌株進(jìn)行的紫外誘變，只能在融合株水平上提高有效成分產(chǎn)量，從而使得突變菌株出現(xiàn)蟲(chóng)草素產(chǎn)量低和出草困難的現(xiàn)象。

原生質(zhì)體融合目的是將雙親的遺傳物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化和互補(bǔ)，從而獲得兼具雙親優(yōu)良性狀的新菌株。然而在遺傳物質(zhì)進(jìn)行重組的過(guò)程中，某些遺傳性狀并不能成功的在融合株中表達(dá)出來(lái)，從而產(chǎn)生融合株偏向某一親本的現(xiàn)象[25-26]。所以在原生質(zhì)體融合育種中，融合株的遺傳特性表達(dá)是有待重點(diǎn)研究的問(wèn)題，尤其是融合株結(jié)實(shí)性表達(dá)，還應(yīng)該做進(jìn)一步深入的研究[27-28]。

2.3Y-90、YP-42高產(chǎn)菌株與親本的RAPD-PCR分析

圖3RAPD-PCRR指紋圖譜Fig.3RAPD fingerprints

采用12 條隨機(jī)引物對(duì)兩個(gè)高產(chǎn)突變株Y-90、YP-42及親本的基因組DNA進(jìn)行RAPD多態(tài)性分析，如圖3所示，兩個(gè)突變株與親本間有共有帶，也存在特異性條帶，如突變株Y-90在引物S7中約為400、740 bp處，突變株YP-42在引物S33中約為750、1 100 bp處等，說(shuō)明兩個(gè)菌株經(jīng)紫外誘變后，在基因組水平上發(fā)生了堿基的轉(zhuǎn)換或移碼突變；且兩個(gè)突變菌株也存在3 個(gè)親本共有帶的缺失，例如突變株Y-90在引物S37中約為1 500 bp處、突變株YP-42在引物S33中約為250 bp處等，說(shuō)明在紫外誘變條件下兩個(gè)突變菌株在基因組信息上發(fā)生了變化。

圖4遺傳相似性聚類分析圖Fig.4Dendriform graph generated from similarity coefficients

由遺傳相關(guān)性聚類分析（圖4）可得，當(dāng)相似系數(shù)為0.40時(shí)，5株菌株均為一類。當(dāng)相似系數(shù)為0.53時(shí)被分為3組：冬蟲(chóng)夏草、融合株與突變株YP-42為一組，突變株Y-90為一組，蛹蟲(chóng)草為一組。當(dāng)相似系數(shù)為0.67時(shí)，冬蟲(chóng)夏草、融合株與突變株YP-42被分為2組：冬蟲(chóng)夏草與融合株為一組，突變株YP-42為一組。說(shuō)明兩個(gè)突變菌株與冬蟲(chóng)夏草的親緣關(guān)系較近，與蛹蟲(chóng)草親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4Y-90、YP-42高產(chǎn)菌株與親本的ITS序列分析

表5ITS序列的雙參數(shù)距離Table5Kimura2-parameter distance for ITS sequences

ITS序列分析結(jié)果顯示，樣本中融合株R1、突變株Y-90、YP-42與冬蟲(chóng)夏草D1的ITS序列長(zhǎng)度相同，均為558 bp，堿基含量也保持一致，G+C的含量均為55.7%；蛹蟲(chóng)草Y1的ITS序列長(zhǎng)度為567 bp，G+C的含量為56.4%；5 個(gè)樣本與蟲(chóng)草屬各菌株間ITS序列的遺傳距離如表5所示，融合株R1、突變株Y-90、YP-42與冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps sinensis）的雙參數(shù)（K2P）距離均為0.000，與蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）的K2P距離為0.181～0.184，結(jié)果表明融合株與突變株在ITS序列上與冬蟲(chóng)夏草完全一致，與蛹蟲(chóng)草有一定的差異，說(shuō)明融合株與突變菌株的ITS序列并沒(méi)有發(fā)生變化。分析原因是融合株在遺傳物質(zhì)重組的過(guò)程中，保留細(xì)胞核活性的冬蟲(chóng)夏草的核DNA占主導(dǎo)作用[8]，從而繼承了冬蟲(chóng)夏草的ITS序列，而ITS序列屬于內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，是非編碼區(qū)，不是功能基因，不能直接反映有效成分的積累[29]，兩個(gè)突變菌株高產(chǎn)性狀的改變并未在ITS序列上表現(xiàn)出來(lái)，使得突變株、融合株的ITS序列與冬蟲(chóng)夏草相同。

3　討論

本實(shí)驗(yàn)分別采用RAPD分子標(biāo)記和ITS序列測(cè)定方法來(lái)分析檢測(cè)突變株基因組序列變化情況，兩種分析方法分別從不同的角度體現(xiàn)了菌株間的遺傳變異情況。RAPD方法通常采用的是隨機(jī)引物，由于不同的引物擴(kuò)增出的DNA片段數(shù)目不同，大小在200～2 000 bp之間，因此存在大量的RAPD標(biāo)記，從而體現(xiàn)了基因組DNA的多態(tài)性[30]，通過(guò)RAPD方法分析得出兩個(gè)突變株與親本在基因組中存在多態(tài)性差異，表明通過(guò)紫外誘變效應(yīng)改變了菌株的遺傳信息，產(chǎn)生了基因突變，突變株的高產(chǎn)性狀是可遺傳性狀。ITS序列目前主要應(yīng)用于物種間的分類鑒定[31]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)ITS序列的測(cè)定，試圖探索融合株、突變株與親本間的基因組序列變化情況，結(jié)果表明ITS序列分析在融合株的鑒定中具有一定的參考價(jià)值，且菌株的ITS序列經(jīng)紫外誘變后并未發(fā)生改變。

基于突變株的性狀一般不穩(wěn)定，尤其在連續(xù)繼代培養(yǎng)時(shí)，所以還需將突變株進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，從活性物質(zhì)上綜合考察，確保所篩選到的高產(chǎn)菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，以便應(yīng)用于以獲得有益成分為目標(biāo)的菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)中，因此本研究中得到的兩個(gè)高產(chǎn)菌株還需進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性研究。

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Ultraviolet-Induced Mutagenesis of Cordyceps sinensis and Cordyceps militaris Protoplast Fusant

QU Hongyan，GUO Chengjin*
（Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin300387，China）

Protoplast fusants between Cordyceps sinensis and Cordyceps militaris were mutagenized by ultraviolet（UV）irradiation for improved production of cordycepic acid and cordycepin in Cordyceps mycelia.Two mutant strains（Y-90and YP-42）were selected showing a1.80-and1.33-fold increase in the production of cordycepic acid and cordycepin when compared with the original funsant strain，respectively.Random amplified polymorphic DNA（RAPD）markers and ribosomal DNA internal transcribed spacer（rDNA-ITS）sequence analysis were used to analyze the genetic variability.The ITS sequence comparison revealed no genetic change after mutagenesis.RAPD analysis showed that the amplified fragments from the two mutants were different from the parent strain，and the acquired characters of the mutants were caused by gene mutation.

Cordyceps sinensis； Cordyceps militaris；mutagenesis；cordycepic acid；cordycepin；fruit body；random amplified polymorphic DNA（RAPD）；rDNA-ITS

Q949.3

A

1002-6630（2015）05-0120-06

10.7506/spkx1002-6630-201505023

2014-03-24

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2012GA610002）

曲鴻雁（1988—），女，碩士，研究方向?yàn)檗飳W(xué)。E-mail：hongyan8069@163.com

郭成金（1952—），男，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)橹参锛?xì)胞營(yíng)養(yǎng)及蕈菌生物學(xué)。E-mail：chengjin@vip.sina.com