大腸菌群冷水凝膠快速檢測(cè)試紙片的研發(fā)

賈振華等

摘要：對(duì)檢測(cè)食品中大腸菌群快速檢測(cè)紙片法進(jìn)行研究。結(jié)果表明，經(jīng)過對(duì)培養(yǎng)基中顯色劑和冷水凝膠成分的優(yōu)化，培養(yǎng)基中氯化三苯四氮唑的濃度為0.4 mg/L時(shí)，試紙片顯色效果最好，形成的菌落數(shù)較多；同時(shí)研究冷水凝膠對(duì)大腸菌群生長(zhǎng)的影響，當(dāng)冷水凝膠濃度高于或低于0.7%時(shí)，大腸菌群生長(zhǎng)速度減慢。采用國(guó)標(biāo)法和紙片法檢測(cè)市售的8種食品，本試紙片法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果一致，紙片法的特異性和重復(fù)性較好。

關(guān)鍵詞： 大腸菌群；快速檢測(cè)；試紙片

中圖分類號(hào)：Q93-332 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）17-4281-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.045

隨著人們生活水平的不斷提高，食品安全問題越來越受到人們的重視，微生物對(duì)食品的污染問題也相應(yīng)地備受關(guān)注。其中，大腸菌群檢測(cè)結(jié)果是判斷食品是否安全的重要指標(biāo)之一。大腸菌群并不是指某一特定細(xì)菌的名稱，而是對(duì)一大類細(xì)菌的概括名稱。它被定義為一群在37 ℃、24 h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢的小桿菌[1]。它主要來源于人畜糞便，作為食品、水、藥品及化妝品等被糞便污染的標(biāo)志，已成為衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)的必檢項(xiàng)目。

目前，對(duì)于食品中大腸菌群的檢測(cè)大多采用國(guó)標(biāo)法，國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、靈敏性均較高，但操作繁雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，不適用于快速檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)人員業(yè)務(wù)水平要求也較高，同時(shí)不便于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。目前檢測(cè)大腸菌群較為先進(jìn)的方法有酶化學(xué)法、生物發(fā)光法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法等[3]。上述方法已被廣泛應(yīng)用，但也存在如滯后性嚴(yán)重、儀器成本高、專業(yè)要求高等不足。食品中大腸菌群的檢測(cè)要求準(zhǔn)確度高，及時(shí)性強(qiáng)，因此急需操作簡(jiǎn)單、快捷的檢測(cè)方法。而紙片法簡(jiǎn)便易行，省去了繁瑣的操作流程。當(dāng)待檢樣品較多時(shí)，選擇該法較合適，尤其是食品安全突發(fā)事件時(shí)，可在短時(shí)間內(nèi)迅速對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，判斷樣本是否被大腸菌群污染。

本研究以濾紙片作為培養(yǎng)基和冷水凝膠的載體。培養(yǎng)基中含有氯化三苯四氮唑（TTC），在大腸菌群脫氫酶的作用下，TTC接受氫生成紅色而不溶于水的三苯甲胺使菌落呈現(xiàn)紅色；同時(shí)，培養(yǎng)基中還添加了乳糖和酸堿指示劑，大腸菌群能分解乳糖產(chǎn)酸而使酸堿指示劑變色，菌落周圍產(chǎn)生黃圈。針對(duì)影響大腸菌群測(cè)試片質(zhì)量的多種因素開展研究，旨在研制快速簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好的測(cè)試片。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC29213、單增李斯特菌CMCC（B）54002-5、副溶血性弧菌ATCC17802、福氏志賀菌CMCC6120513、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028，均購(gòu)于廣東省微生物研究所。

1.1.2 試劑 培養(yǎng)基配方：每升培養(yǎng)基中含胰蛋白胨15.0 g、牛肉膏5.0 g、氯化納5.0 g、磷酸氫二鉀5.0 g、乳糖15.0 g，pH 6.3～6.5；冷水凝膠配方：質(zhì)量體積比為0.2%～0.4%聚丙烯酸鈉、0.1%～0.3%黃原膠、0.1%～0.2%卡拉膠和0.1%～0.2%魔芋膠；濾紙片為薄層層析濾紙。

1.1.3 檢測(cè)樣品來源 從武漢市部分超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集或購(gòu)買樣品（牛奶、大白菜、蛋糕、啤酒、果汁、蜂蜜、鹵牛肉）共7份。

1.1.4 儀器設(shè)備 智能恒溫恒濕箱（Hst-250）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 將培養(yǎng)基和冷水凝膠加入到去離子水中，定容至1 000 mL，在121 ℃滅菌15 min，再加入1.25 mL濃度為1 mg/mL脫氧膽酸鈉、8 mL 1.6%溴甲酚紫溶液、5 mL 0.8% TTC溶液，混勻后備用。

1.2.2 樣品制備 在無菌條件下，將25 g/mL樣品（固體樣品粉碎），放入裝有225 mL無菌生理鹽水和適量玻璃珠的500 mL燒杯中，經(jīng)充分振搖，依次無菌稀釋成10-1、10-2、10-3稀釋液。

1.2.3 紙片法制備 篩選白色、無毒、中速、密度均勻、吸附力合格的濾紙，將濾紙裁剪成合適的尺寸，通常為5.0 cm×5.0 cm。將濾紙片于121 ℃滅菌15 min。用無菌鑷子夾取濾紙浸泡在上述制備的培養(yǎng)基中浸泡2 h，拿出平放于托盤中，37 ℃烘干。分裝于已滅菌的聚丙烯塑料口袋內(nèi)，密封備用。

1.2.4 樣品檢測(cè) 采用無菌操作將制備的樣品稀釋液取1 mL分別涂布于紙片上，每個(gè)稀釋液涂布 3個(gè)，將涂布好的紙片放入無菌袋，置于培養(yǎng)箱中37 ℃，培養(yǎng)14～16 h。結(jié)果判定：紙片上出現(xiàn)紅色菌落，其周圍有黃圈者為陽性，根據(jù)測(cè)試上的紅色菌落數(shù)可以計(jì)算大腸菌群的濃度。

1.2.5 比對(duì)試驗(yàn) 采用大腸菌群國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法GB 4789.3-2010 與紙片法結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紙片法檢測(cè)大腸埃希菌結(jié)果

將大腸埃希氏菌ATCC25922過夜培養(yǎng)，將1mL菌懸液8 000 r/min離心5 min，將菌體重懸于1 mL無菌水中，按照10倍稀釋，稀釋到10-6后，將1 mL菌懸液或無菌生理鹽水滴加至紙片法上，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)16～24 h，觀察紙片上菌落的生長(zhǎng)情況。在紙片法上呈均勻紫藍(lán)色者為陰性（圖1A），紙片上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，外周黃暈或紙片產(chǎn)生黃色背景者為陽性紙片（圖1B）。

2.2 TTC濃度對(duì)試紙片檢測(cè)結(jié)果的影響

不同濃度TTC用量下，大腸埃希氏菌ATCC25922菌懸液培養(yǎng)后計(jì)數(shù)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)TTC濃度為0.4 mg/L時(shí)，菌懸液形成菌落清晰，其生長(zhǎng)呈現(xiàn)最好狀態(tài)，即紅色菌落數(shù)目最多。在TTC的量大于或小于0.4 mg/L時(shí)，所生成的紅色菌落逐漸減少。

2.3 冷水凝膠對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

在培養(yǎng)基中加入可以替代瓊脂的冷水凝膠，規(guī)避了瓊脂在低溫下容易凝固的不足，同時(shí)，也使紙片法質(zhì)地更為緊密均勻。如圖3所示，在培養(yǎng)基中加入不同量的冷水凝膠后，菌落形成出現(xiàn)較大變化。當(dāng)每100 mL培養(yǎng)基中加入0.7 g冷水凝膠時(shí)菌落生長(zhǎng)最好。用量超過0.7 g時(shí)，菌落數(shù)相對(duì)減少。

2.4 國(guó)標(biāo)法與紙片法法檢驗(yàn)比對(duì)

采用平板計(jì)數(shù)法和測(cè)試法分別檢測(cè)市售菠菜、牛奶、大白菜、鹵牛肉、蛋糕、果汁、豬肉7種樣品，檢測(cè)結(jié)果見表1。由表1可知，國(guó)標(biāo)法與紙片法檢測(cè)結(jié)果基本一致。

2.5 檢測(cè)特異性試驗(yàn)

分別將大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC29213、單增李斯特菌CMCC（B）54002-5、副溶血性弧菌ATCC17802、福氏志賀菌CMCC6120513、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)物用滅菌生理鹽水作10倍遞增稀釋，取合適稀釋度（一般10-5～10-7為宜）分別接種于測(cè)試片，每片各1 mL，設(shè)3次重復(fù)；同時(shí)接種乳糖膽鹽發(fā)酵管3支，每支1 mL，設(shè)3次重復(fù)。將上述測(cè)試片和發(fā)酵管置37 ℃培養(yǎng) 18～24 h。大腸埃希氏菌ATCC259221培養(yǎng) 24 h后產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判定為大腸菌群陽性；采用紙片法培養(yǎng)16 h，大腸埃希氏菌ATCC2592211出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，其周圍變黃或整張紙片變黃，按標(biāo)準(zhǔn)判定為大腸菌群陽性。而其他5株 （金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌、福氏志賀菌、鼠傷寒沙門氏菌）在紙片法均不變黃，也無紅色斑點(diǎn)，按標(biāo)準(zhǔn)判定為大腸菌群陰性。紙片法檢測(cè)結(jié)果與發(fā)酵法完全一致，說明紙片法特異性與經(jīng)典的發(fā)酵法相一致。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

紙片法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果由表2中可知，在牛奶中添加不同濃度的大腸菌群，紙片法5次檢測(cè)結(jié)果與九管發(fā)酵法一致，表明本紙片法重復(fù)性較好。

3 小結(jié)與討論

大腸群菌作為人、畜糞便污染指標(biāo)而成為食品和餐（飲）具衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，常采用傳統(tǒng)的發(fā)酵法檢驗(yàn)。但傳統(tǒng)發(fā)酵法操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于食品和餐（飲）具的日常檢測(cè)和監(jiān)督管理[4-7]。可采用紙片法取代發(fā)酵法，兩法的檢測(cè)結(jié)果基本一致，而紙片法具有簡(jiǎn)便、快速、省時(shí)、省力等優(yōu)點(diǎn)。

紙片法在快速檢驗(yàn)食品中大腸菌群有較好的效果，但食品成分比水要復(fù)雜的多，細(xì)菌相的組成也比較復(fù)雜，影響因素也多，因此下階段要進(jìn)一步深入對(duì)營(yíng)養(yǎng)液配方的研究，使紙片法適合大部分食品的檢測(cè)需求，或者根據(jù)不同類別的食品研制專用檢測(cè)紙片。

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