劉素梅，杜紅鴿，方忠意，張躍京，臧和英，邱天寶，王　麗

（河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450008）

復(fù)方馬度米星銨預(yù)混劑中尼卡巴嗪含量測(cè)定方法的研究

劉素梅，杜紅鴿，方忠意，張躍京，臧和英，邱天寶，王麗

（河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450008）

建立了高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方馬度米星銨預(yù)混劑中尼卡巴嗪的含量，采用Waters X-Bridge C18（150 NN 4.6 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-水（用磷酸調(diào)pH至3.0）為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)0～5 min為297 nm，5 min開始為350 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣體積為20 μl。HDP的回歸方程為：y=23452x-456，相關(guān)系數(shù)r=0.99999，DNC的回歸方程為：y=102388x+5296，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，即HDP在0.29～29.12 μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性，DNC在0.71～70.90 μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可以通過同時(shí)測(cè)定尼卡巴嗪中HDP和DNC來計(jì)算尼卡巴嗪的含量。

復(fù)方馬度米星銨預(yù)混劑；尼卡巴嗪；HDP；DNC；高效液相色譜法

復(fù)方馬度米星銨預(yù)混劑收載于農(nóng)業(yè)部公告第1435號(hào)［1］中，為尼卡巴嗪和馬度米星銨的復(fù)方制劑，作為飼料添加劑用于防治雞球蟲病。方中尼卡巴嗪為4，4′-二硝基均二苯脲（DNC）和2-羥基-4，6-二甲基嘧啶（HDP）的復(fù)合物，對(duì)雞的多種艾美耳球蟲，如柔嫩、脆弱、毒害巨型、堆形、布氏艾美耳球蟲均有良好的防治效果［2］。

標(biāo)準(zhǔn)中尼卡巴嗪含量測(cè)定采用的紫外分光光度法，并且通過只測(cè)定4，4′-二硝基苯脲（DNC）的含量來控制尼卡巴嗪的含量，樣品需經(jīng)反應(yīng)顯色，操作較煩瑣，且樣品溶液不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差，每次顯色后必須快速測(cè)定，無法同時(shí)測(cè)定多批樣品。只有沈祥廣等［3］通過高效液相色譜法對(duì)HDP和DNC進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定，但該方法流動(dòng)相配制煩瑣，且HDP易和溶劑峰重合在一起。根據(jù)獸藥典委員會(huì)的要求，將尼卡巴嗪原料及制劑中尼卡巴嗪含量測(cè)定方法進(jìn)一步完善，修訂為高效液相色譜法，并擬將該標(biāo)準(zhǔn)收載在《中國(guó)獸藥典》2015年版中。

1　儀器與試藥

Waters Alliance高效液相色譜系統(tǒng)：包括2695分離系統(tǒng)、2489紫外檢測(cè)器、Empower2色譜工作站；METTLER XP205電子天平；MILIPORE超純水處理器等。

復(fù)方馬度米星銨預(yù)混劑由濮陽(yáng)泓天威藥業(yè)有限公司（批號(hào)為GR201307002）、河南孟成生物藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)為20130701）和浙江匯能動(dòng)物藥品有限公司（批號(hào)為413022518）提供；尼卡巴嗪對(duì)照品由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號(hào)為H0330903；液相用甲醇、乙腈為色譜純?cè)噭?，水為超純水，其他試劑為分析純?/p>

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取尼卡巴嗪對(duì)照品50 mg，置50 ml量瓶中，加二甲基亞砜20 ml，超聲使溶解，加乙腈稀釋至刻度，搖勻；臨用前用乙腈-水（6∶4）稀釋成濃度為1、5、10、40、80和100 μg/ml的系列對(duì)照品溶液，過0.45 μm微孔濾膜即得。

2.1.2供試品溶液的制備取本品0.63 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，加二甲基亞砜20 ml，超聲提取20 min，加乙腈稀釋至刻度，搖勻；精密量取上清液2 ml，置50 ml量瓶中，加乙腈-水（6∶4）稀釋至刻度，搖勻。

2.2色譜條件的選擇

尼卡巴嗪中HDP具有較大的極性，在反相色譜柱上保留較弱，很容易和溶劑二甲基亞砜重合在一起，參考不同文獻(xiàn)［4-7］，選取C18柱為色譜柱，考察不同的溶劑系統(tǒng)，最終采用乙腈-水（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0i 0.1）系統(tǒng)［8］?？紤]到HDP保留較弱，出峰快，DNC出峰慢，且預(yù)混劑所用輔料為玉米芯，空白輔料有吸收峰，為避免這些吸收峰對(duì)組分的影響，選用了梯度洗脫，具體程序見表1。

表1　梯度程序表

經(jīng)光電二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，HDP的最大吸收波長(zhǎng)為297 nm，DNC最大吸收波長(zhǎng)為350 nm，所以在檢測(cè)過程中需要切換波長(zhǎng)，0～5 min為297 nm，5 min開始為350 nm。

2.3線性范圍

精密稱取尼卡巴嗪對(duì)照品50 mg，置50 ml量瓶中，加二甲基亞砜20 ml，超聲溶解，加乙腈定容至刻度，搖勻；用乙腈-水（6∶4）稀釋成濃度為1、5、10、40、80和100μg/ml的系列對(duì)照品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對(duì)照品溶液濃度與相應(yīng)的組分峰面積算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，HDP的回歸方程為：y=23452x-456，相關(guān)系數(shù)r=0.99999，DNC的回歸方程為：y=102388x+ 5296，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，即HDP在0.29～29.12 μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性，DNC在0.71～70.90 μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性。

2.4準(zhǔn)確度

取空白輔料0.63 g，共取9份，精密稱定，分別加入尼卡巴嗪原料40 mg、50 mg和60 mg共3個(gè)濃度水平，每個(gè)水平3份。按照2.1.2項(xiàng)下供試品制備方法進(jìn)行處理，進(jìn)高效液相色譜儀分析，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2　復(fù)方馬度米星銨預(yù)混劑準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

從結(jié)果可以看出，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定兩個(gè)組分的含量，回收率高。

2.5精密度

取同一批次樣品0.63 g，共取6份，分別精密稱定，按2.1.2項(xiàng)下供試品制備方法進(jìn)行處理，進(jìn)高效液相色譜儀分析，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，HDP的RSD為0.8%，DNC的RSD為0.4%，結(jié)果表明，該方法具有很好的精密度。

2.6專屬性

經(jīng)過考察生產(chǎn)企業(yè)的復(fù)方馬度米星銨預(yù)混劑生產(chǎn)工藝，在生產(chǎn)過程中使用的可能影響到藥物成分質(zhì)量的試劑有苯甲醇和乙酸乙酯，筆者考察了這兩種試劑對(duì)尼卡巴嗪色譜峰的影響。稱取空白輔料0.63 g，分別加入1ml的苯甲醇和乙酸乙酯及2 mg的馬度米星銨，按2.1.2項(xiàng)下供試品制備方法進(jìn)行處理，進(jìn)高效液相色譜儀分析，在該色譜條件下尼卡巴嗪兩主峰無干擾。

2.7穩(wěn)定性

取供試品0.63 g，按2.1.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，分別在0、1、8、12和24 h進(jìn)樣，考察供試品溶液穩(wěn)定性，兩組分峰面積RSD分別為0.8%和0.5%，結(jié)果顯示，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8耐用性

用XBridge C18（5 μm，4.6 ON 150 mm）色譜柱分別考察了不同柱溫、不同流速和流動(dòng)相不同pH值對(duì)色譜峰的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同柱溫和不同流速對(duì)色譜峰的柱效、分離度等影響不大。流動(dòng)相的水相pH值為2.5和3.5時(shí)，兩主峰的理論塔板數(shù)下降幅度很大，pH值為3.5時(shí)，DNC峰展寬，出現(xiàn)肩峰；pH值為2.8和3.2時(shí)，兩主峰的理論塔板數(shù)分別較pH值為2.5和3.5提高很多，能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)需求，所以pH值應(yīng)盡量控制在3.0i 0.2。

2.93批樣品測(cè)定

取3批復(fù)方馬度米星銨預(yù)混劑，每批3份，分別精密稱定，按2.1.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，進(jìn)高效液相色譜儀分析，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量及RSD，結(jié)果見表3。

表3　三批樣品測(cè)定結(jié)果

由表3可知，該方法重復(fù)性好，可以實(shí)現(xiàn)HDP和DNC的同時(shí)測(cè)定。

3　討論與結(jié)論

原標(biāo)準(zhǔn)中尼卡巴嗪含量測(cè)定采用的紫外分光光度法，并且通過只測(cè)定4，4′-二硝基苯脲（DNC）的含量來控制尼卡巴嗪的含量，供試品經(jīng)反應(yīng)顯色，操作較煩瑣，且樣品不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差。修改后采用高效液相色譜法，兩種組分同時(shí)測(cè)定，結(jié)果以兩組分含量的和來計(jì)算，操作較原來簡(jiǎn)便了好多，樣品的重現(xiàn)性很好，較原來的方法有很大的優(yōu)越性。

HDP保留較弱，DNC保留很強(qiáng)，出峰慢，且預(yù)混劑所用輔料為玉米芯，空白輔料有吸收峰，為避免這些吸收峰對(duì)組分的影響，選用了梯度洗脫。

該方法簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，可以進(jìn)行大批量樣品的同時(shí)測(cè)定，對(duì)尼卡巴嗪中的兩個(gè)組分進(jìn)行控制，可以更好地控制制劑的質(zhì)量。

［1］農(nóng)業(yè)部獸藥評(píng)審中心.農(nóng)業(yè)部公告第1435號(hào)［S］.2010.

［2］中國(guó)獸藥典委員會(huì).獸藥使用指南化學(xué)藥品卷［S］.2011.

［3］沈祥廣，賀利民，余靜賢，等.尼卡巴嗪原料藥及制劑中4，4′-二硝基均苯二脲與2-羥基-4，6-二甲基嘧啶的HPLC法同時(shí)測(cè)定［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào).2010，29（5）：523-526.

［4］邵慶均，張金枝，宣士榮，等.反相高效液相色譜法測(cè)定飼料中尼卡巴嗪含量［J］.分析化學(xué).2003，31（11）：1376-1379.

［5］陳麗，譚寶玲，馮建文.HPLC法檢測(cè)飼料預(yù)混劑中尼卡巴嗪的含量［J］.飼料工業(yè).2006，27（14）：52-53.

［6］孫雷，張?bào)P，劉智宏，等.雞蛋和雞肉中尼卡巴嗪殘留檢測(cè)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究［J］.中國(guó)獸藥雜志. 2008，42（5）：1-4.

［7］周偉偉，鐘平，薛偉芳，等.雞組織中尼卡巴嗪殘留HPLC檢測(cè)方法的研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào).2009，29（12）：1590-1592.

［8］劉素梅，班付國(guó)，韓立，等.高效液相色譜法測(cè)定尼卡巴嗪含量的方法建立［J］.中國(guó)獸藥雜志.2014，48（5）：51-55.

S859.79

1004-5090（2015）11-0005-03

2015-08-21）