解瑞欽 李寧 劉思當(dāng) 張清林

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鴨坦布蘇病毒對7周齡鴨的致病性研究

解瑞欽①李寧②劉思當(dāng)②張清林③

（①山東大寶養(yǎng)殖加工有限責(zé)任公司 山東新泰 271200 ②山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東泰安 ③泰山職業(yè)技術(shù)學(xué)院 山東泰安）

為研究鴨坦布蘇病毒對青年鴨的致病性，對7周齡的櫻桃鴨肌肉接種病毒建立人工感染模型，觀察感染鴨的臨床表現(xiàn)、病理變化、免疫反應(yīng)及病毒在宿主體內(nèi)的消長規(guī)律。結(jié)果顯示7周齡的攻毒鴨在接種病毒后第3~4天出現(xiàn)暫時(shí)性的食欲減退、精神不振，但未出現(xiàn)死亡。剖檢可見感染鴨心內(nèi)膜出血，肝、脾臟腫脹，回腸淋巴濾泡處黏膜腫脹。組織病理學(xué)變化主要集中在心、肝、腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性，間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤，大腦呈典型的病毒性腦炎病變。感染鴨自攻毒后第1天各主要組織器官就能檢測到病毒，但病毒含量從第3天達(dá)到峰值后迅速消減，第9天時(shí)已經(jīng)檢測不到病毒，同時(shí)7周齡感染鴨自攻毒后第3天血清中就出現(xiàn)中和抗體并以較高水平維持。結(jié)果表明，鴨坦布蘇病毒能迅速侵入宿主體內(nèi)并大量復(fù)制，呈泛嗜性特征，但7周齡青年鴨抵抗力較強(qiáng)，能快速產(chǎn)生中和抗體以抵抗病毒。

鴨坦布蘇病毒 7周齡鴨 致病性

鴨坦布蘇病毒病于2010年首次在我國發(fā)生、流行，該病主要引起蛋鴨產(chǎn)蛋下降[1, 2]，各品種鴨均可感染[3]，同時(shí)雞、鵝也出現(xiàn)過感染發(fā)病的報(bào)道[4]。目前，該病的病原學(xué)、血清學(xué)檢測方法已成功建立，其流行病學(xué)調(diào)查、病毒分子生物特性和疫苗研制等方面已經(jīng)開展大量研究[5-12]，但是鴨坦布蘇病毒對青年鴨致病性的系統(tǒng)研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過建立7周齡青年鴨人工感染模型，研究青年鴨感染之后的臨床表現(xiàn)、剖檢病變、組織病理學(xué)變化、免疫反應(yīng)及病毒在宿主體內(nèi)的分布，以期為該病的診斷及防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒及試驗(yàn)動(dòng)物 鴨坦布蘇病毒（FX 2010株）的病毒滴度為105TCID50·ml-1，-80 ℃保存；7周齡櫻桃谷鴨80只(由本實(shí)驗(yàn)室從1日齡飼養(yǎng)至7周齡)，攻毒前經(jīng)檢測坦布蘇病毒及其抗體均為陰性。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)攻毒組和對照組，每組各40只。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 攻毒組鴨每只肌肉接種0.4ml含毒尿囊液（105TCID50·ml-1），對照組每只接種相同劑量的正常SPF雞胚尿囊液。將2組分開隔離飼養(yǎng)，均自由采食和飲水，于攻毒后1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21天每組隨機(jī)取3只鴨（不計(jì)死亡鴨），采集樣品。

1.3 樣品采集及處理 每天觀察攻毒鴨的臨床表現(xiàn)，定期剖檢并記錄眼觀病變。取心、肝、脾、肺、腎和腦組織制作常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡觀察組織病變。血清樣品經(jīng)阻斷ELISA方法檢測中和抗體[8]，同時(shí)通過熒光定量PCR方法檢測病毒在各組織中的含量變化[13]。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及剖檢病變 整個(gè)試驗(yàn)過程中對照鴨未出現(xiàn)任何臨床癥狀，剖檢也沒觀察到明顯病變。攻毒鴨在接種病毒后第3~4天出現(xiàn)一過性的食欲下降，精神沉郁，拉黃綠色稀糞，同時(shí)部分鴨不愛活動(dòng)，第5~7天后，其采食和精神逐漸恢復(fù)正常，整個(gè)試驗(yàn)中攻毒鴨未出現(xiàn)死亡。剖檢攻毒鴨，主要觀察到：心內(nèi)膜出血，脾臟腫大呈斑駁狀，回腸淋巴濾泡處黏膜腫脹。

2.2 組織病理學(xué)檢測 對照組鴨各組織器官未見明顯病變，但攻毒鴨出現(xiàn)病變(圖1)，主要表現(xiàn)在：攻毒后第5天，心肌纖維顆粒變性并伴有炎性細(xì)胞浸潤(圖1-A)；肝細(xì)胞空泡變性、部分壞死，同時(shí)間質(zhì)有炎性細(xì)胞及少量異嗜性粒細(xì)胞浸潤(圖1-B)；脾臟淋巴細(xì)胞稀疏并出現(xiàn)少量的異嗜性粒細(xì)胞(圖1-C)；肺臟和腎臟病變較輕，僅見肺泡壁毛細(xì)血管輕微充血，局部出血，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)顆粒變性(圖1-D、圖1-E)；攻毒后第5天，腦部血管周圍間隙擴(kuò)大，第9天時(shí)出現(xiàn)“袖套現(xiàn)象”、“噬神經(jīng)現(xiàn)象”等典型病毒性腦炎病變(圖1-F)。

圖1 攻毒后內(nèi)臟器官的病變

1A.攻毒后5d，心肌纖維顆粒變性，間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤；1B.攻毒后5d，肝細(xì)胞空泡變性，間質(zhì)異嗜性粒細(xì)胞浸潤；1C.攻毒后5d，脾臟中有少量的異嗜性粒細(xì)胞浸潤；1D.攻毒后5d，肺臟局部出血；1E.攻毒后5d，腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性；1F.攻毒后9d，呈典型病毒性腦炎病變

2.3 組織含毒量檢測

圖2 雛鴨攻毒后各組織熒光定量PCR檢測結(jié)果

從圖2可以看出，攻毒后第1天，7周齡鴨的心、肝、脾、肺、腎和腦各組織均能檢測到病毒，且脾臟的含毒量最高；攻毒后第3天，除脾臟外各組織含毒量均呈上升趨勢，其中以心臟的病毒含量最高；攻毒后第5天，各組織的含毒量均逐漸下降，其中肝臟和肺臟已經(jīng)檢測不到病毒載量；攻毒后第7天，各組織的含毒量繼續(xù)下降，此時(shí)心臟和腦的病毒含量也達(dá)不到檢測閾值，攻毒后第9天，各組織均檢測不到病毒載量(數(shù)據(jù)未給出)。

2.4 血清中和抗體檢測

+=中和抗體陽性臨界值；—=中和抗體陰性臨界值

圖3 雛鴨血清中和抗體檢測結(jié)果

如圖3所示，整個(gè)試驗(yàn)過程中對照組鴨血清抗體保持陰性，但攻毒鴨早在攻毒后第3天血清中就出現(xiàn)微弱的陽性抗體，第5天時(shí)抗體水平已經(jīng)非常高。在本試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，7周齡攻毒鴨的抗體含量仍然處于較高水平。

3 討論

目前，鴨坦布蘇病毒病在我國仍廣泛流行，嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展，但是觀察到該病對不同日齡鴨的致病性顯著不同，臨床上其對雛鴨和產(chǎn)蛋鴨的致病性較強(qiáng)，但7周齡以上的青年鴨較少發(fā)病。本試驗(yàn)采用7周齡櫻桃谷鴨肌肉接種坦布蘇病毒，成功構(gòu)建感染模型。攻毒鴨在接種病毒后第3~4天開始出現(xiàn)食欲減退、精神沉郁，部分鴨喜臥、不愿活動(dòng)，但第6天后，攻毒鴨采食和精神逐漸恢復(fù)正常，整個(gè)過程中未見死亡。剖檢病變、組織病理學(xué)檢測以及各組織含毒量檢測結(jié)果顯示，鴨坦布蘇病毒也可感染7周齡青年鴨，并且能迅速侵入宿主各組織器官，潛伏期約為1~2d，雖然該病毒不會(huì)引起青年鴨的發(fā)病死亡，但會(huì)導(dǎo)致其出現(xiàn)一過性的厭食、精神不振，而且能導(dǎo)致明顯的病毒性腦炎病變。7周齡以上的青年鴨體格強(qiáng)壯生長發(fā)育快，抵抗力非常強(qiáng)，攻毒鴨在接種病毒后的第3天就能產(chǎn)生明顯的血清中和抗體，并且一直持續(xù)較長時(shí)間使得宿主能得到很好的免疫保護(hù)。臨床上該階段的鴨子感染鴨坦布蘇病毒后一般呈隱性感染，所以非常容易被忽視，而其一旦感染必將嚴(yán)重威脅雛鴨或蛋鴨健康，所以要加強(qiáng)對青年鴨的抗體監(jiān)測。

[1] Su J, Li S, Hu X, et al. Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus, a new Tembusu-related flavivirus[J]. PLoS One. 2011, 6(3): e18106.

[2] Yan P, Zhao Y, Zhang X, et al. An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainland China[J]. Virology. 2011, 417(1): 1-8.

[3] Tang Y, Diao Y, Chen H, et al. Isolation and Genetic Characterization of a Tembusu Virus Strain Isolated From Mosquitoes inShandong, China[J]. Transbound Emerg Dis. 2013.

[4] Liu M, Chen S, Chen Y, et al. Adapted Tembusu-like virus in chickens and geese in China[J]. J Clin Microbiol. 2012, 50(8): 2807-2809.

[5] 劉友生, 彭春香等. 2010-2011年中國部分地區(qū)禽坦布蘇病毒感染調(diào)查及分子變異分析[J]. 中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2012(01): 47-53.

[6] Tang Y, Diao Y, Gao X, et al. Analysis of the complete genome of Tembusu virus, a flavivirus isolated from ducks in China[J]. Transbound Emerg Dis. 2012, 59(4): 336-343.

[7] Zhu W, Chen J, Wei C, et al. Complete genome sequence of duck Tembusu virus, isolated from Muscovy ducks in southern China[J]. J Virol. 2012, 86(23): 13119.

[8] Li X, Li G, Teng Q, et al. Development of a blocking ELISA for detection of serum neutralizing antibodies against newly emerged duck Tembusu virus[J]. PLoS One. 2012, 7(12): e53026.

[9] Jiang T, Liu J, Deng Y Q, et al. Development of RT-LAMP and real- time RT-PCR assays for the rapid detection of the new duck Tembusu-like BYD virus[J]. Arch Virol. 2012, 157(12): 2273-2280.

[10] Huang X, Han K, Zhao D, et al. Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from geese in China[J]. Research in veterinary science. 2012.

[11] Tang Y, Diao Y, Yu C, et al. Characterization of a Tembusu virus isolated from naturally infected house sparrows (Passer domesticus) in Northern China[J]. Transbound Emerg Dis. 2013, 60(2): 152-158.

[12] Jiang T, Liu J, Deng Y Q, et al. Development of RT-LAMP and real-time RT-PCR assays for the rapid detection of the new duck Tembusu-like BYD virus[J]. Arch Virol. 2012, 157(12): 2273-2280.

[13] 于春梅，刁有祥，唐熠等. 坦布蘇病毒熒光定量RT-PCR方法的建立[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2012(21): 4492-4500.

（2015–04–22）

S852.65+9

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1007-1733(2015)07-0001-03

山東省科技成果轉(zhuǎn)化基金項(xiàng)目(魯科農(nóng)[2013]56號)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究與示范(20123082)