柑橘檸檬苦素大孔樹脂分離純化方法

龐　立，鄧子牛，劉吉凱，王仁才

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128）

柑橘檸檬苦素大孔樹脂分離純化方法

龐立，鄧子牛，劉吉凱，王仁才*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128）

以柑橘檸檬苦素為考察指標(biāo)，研究大孔樹脂分離純化檸檬苦素的工藝條件。結(jié)果表明，D101大孔樹脂對柑橘檸檬苦素有較好的吸附分離性能，是分離純化柑橘檸檬苦素的適宜大孔樹脂；D101大孔樹脂分離純化柑橘檸檬苦素的最佳工藝條件為：上樣流速1 mL/min、上樣質(zhì)量濃度0.5 mg/mL、用 pH 6、80%的乙醇溶液作洗脫劑、洗脫流速2 mL/min。通過樹脂回收重復(fù)使用，發(fā)現(xiàn)D101樹脂通過再生處理后，其吸附性能未有明顯降低，可以重復(fù)使用。采用上述方法得到D101大孔樹脂對檸檬苦素的吸附率為88.53%，解吸率為93.47%，得率為82.75%。高效液相色譜檢測可知，檸檬苦素的含量達(dá)到了92.79%。

柑橘；檸檬苦素；大孔樹脂；分離；純化

中國是世界柑橘的主起源地之一，也是世界柑橘生產(chǎn)大國。我國柑橘種植面積及總產(chǎn)量均居世界首位，栽培面積占全球的30%左右，產(chǎn)量占全球的26%左右。然而，我國柑橘產(chǎn)量雖然巨大，但柑橘加工利用程度卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，許多柑橘資源還未能得到充分地開發(fā)利用，其中就包括柑橘檸檬苦素。經(jīng)研究表明，檸檬苦素在抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、改善睡眠、抗菌、抗焦慮，調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇含量、防止動脈粥樣硬化等方面都具有顯著效果［1-5］。另外，柑橘中的三萜類物質(zhì)在抗腫瘤方面有很好的成效，檸檬苦素及其類似物就是其中一類重要組分［6-8］。目前許多柑橘落果已經(jīng)作為國內(nèi)很多藥廠的制藥原材料［9］，而梓檬苦素作為柑橘主要活性功能成分之一［10］，研究柑橘檸檬苦素的提取、分離純化及其檢測，對以柑橘為原料的梓檬苦素產(chǎn)品開發(fā)利用具有積極作用。

大孔吸附樹脂是近代發(fā)展起來的一類有機(jī)高聚物吸附劑，具有多孔性與較大的比表面積，主要是通過其物理作用從溶液當(dāng)中有選擇性地吸附有機(jī)物，從而達(dá)到分離純化的目的［11-12］。而用吸附樹脂提取三萜類化合物，制所得產(chǎn)品純度高、質(zhì)量穩(wěn)定、成本低［13-14］。另外，大孔樹脂法具有吸附容量大、吸附速度快、選擇性好、再生簡便等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化［15-16］。本研究旨在根據(jù)柑橘檸檬苦素的結(jié)構(gòu)特性，通過優(yōu)化大孔樹脂分離純化柑橘檸檬苦素的工藝，探討高含量檸檬苦素的制備方法，為柑橘檸檬苦素的規(guī)模生產(chǎn)及綜合利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

柑橘果實（湖南）烘干至恒質(zhì)量，打粉。

HPD450、HPD600、AB-8、D101、DM130、聚酰胺30-60、聚酰胺60-100大孔吸附樹脂 河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司；梓檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純，≥8%）成都曼斯特生物科技有限公司；無水乙醇、二氯甲烷（均為分析純）、乙腈（色譜純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；DR-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DHG-9246A電熱恒溫干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1檸檬苦素粗提液的制備

準(zhǔn)確稱取已烘干的柑橘果實粉末10 g，用85%的乙醇溶液300 mL于55 ℃條件下超聲提取25 min［17-18］。提取后抽濾，濾液在45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，以足量的二氯甲烷分3 次萃取，保留并合并二氯甲烷相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（45 ℃）至干，用過量的75%乙醇溶解，經(jīng)濃縮至無醇味后用蒸餾水定容到100 mL。

1.3.2檸檬苦素高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定

以檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)樣，色譜條件為：液相用色譜柱為WeLchrom C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相釆用V乙腈∶V水=45∶55等度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3大孔樹脂篩選

1.3.3.1吸附量和吸附率測定

將樹脂用95%乙醇溶液洗至無色后，用蒸餾水洗至無醇味。然后用5% HCl溶液洗至無色，用水洗至中性，再用5% NaOH溶液洗至無色，用水洗至中性。稱取HPD450、HPD600、AB-8、D101、DM130、聚酰胺30-60、聚酰胺60-100大孔吸附樹脂各1 g，分別置于7 個100 mL的錐形瓶中；取檸檬苦素粗提液50 mL，定容至250 mL，搖勻后各取50 mL加入7個錐形瓶中，于恒溫振蕩器內(nèi)在30 ℃，40 r/min條件下振蕩2 h，取出后冷卻至室溫，分別過濾10 mL，采用HPLC法測過濾后流出液中檸檬苦素質(zhì)量濃度，得到靜態(tài)吸附檸檬苦素的吸附量（μg/g）和吸附率（E/%）［19］。

式（1）、（2）中：Q為樹脂對檸檬苦素的飽和吸附量/（μg/g）；C0為吸附前檸檬苦素溶液的起始質(zhì)量濃度/（μg/mL）；Cr為吸附后過濾液的剩余質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為檸檬苦素溶液體積/mL；G為樹脂質(zhì)量/g。

1.3.3.2解吸率測定

對上述處理后的樹脂用蒸餾水洗至流出液無色，濾紙吸干后將其置于錐形瓶中，各加入80%乙醇溶液200 mL，在30 ℃、40 r/min條件下振蕩3 h，取出后冷卻至室溫，分別過濾各洗脫液10 mL，HPLC法測剩余液體中檸檬苦素質(zhì)量濃度，得到靜態(tài)吸附檸檬苦素解吸率［19］。

式中：C為解吸后洗脫液中檸檬苦素質(zhì)量濃度/（μg/mL）；W為樹脂對檸檬苦素的飽和吸附量/（μg/g）；V為洗脫液的體積/mL。

1.3.4大孔樹脂柱分離純化柑橘檸檬苦素方法的確定

1.3.4.1最佳吸附和解吸pH值的確定

按照1.3.3節(jié)靜態(tài)吸附與解吸實驗方法，用pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的柑橘檸檬苦素粗提液進(jìn)行靜態(tài)吸附實驗，洗脫液為80%乙醇溶液；柑橘檸檬苦素粗提液進(jìn)行吸附后，分別用pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的80%乙醇溶液進(jìn)行解吸。HPLC法測剩余液體中檸檬苦素質(zhì)量濃度，確定最佳柑橘檸檬苦素粗提液的pH值及解吸液pH值。

1.3.4.2上樣質(zhì)量濃度的確定

將已經(jīng)預(yù)處理好的樹脂10 g用濕法裝柱，將柑橘檸檬苦素提取液配成質(zhì)量濃度為0.6、0.5、0.4、0.3、0.2 mg/mL，并全部調(diào)至中性，以10 mL上柱，用蒸餾水以1 mL/min流速沖洗。然后用80%的乙醇溶液（pH 6）進(jìn)行以2 mL/min的流速洗脫，收集乙醇洗脫液，并濃縮定容至100 mL。通過考察洗脫液中檸檬苦素含量，確定其最佳上樣質(zhì)量濃度。

1.3.4.3上樣流速的確定

將已經(jīng)預(yù)處理好的樹脂10 g用濕法裝柱，將柑橘檸檬苦素提取液配成質(zhì)量濃度0.5 mg/mL，pH值為 7，上樣10 mL，用蒸餾水以2 mL/min流速沖洗。然后用80%的乙醇溶液（pH 6）以0.5、0.75、1、2、3 mL/min的流速洗脫，分別收集乙醇洗脫液，并濃縮定容至100 mL。通過考察洗脫液中檸檬苦素含量，確定其最佳上樣液流速。

1.3.4.4解吸醇體積分?jǐn)?shù)的確定

將已經(jīng)預(yù)處理好的樹脂10 g用濕法裝柱，將柑橘檸檬苦素提取液配成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，pH值為7，上樣10 mL，用蒸餾水以1 mL/min流速沖洗。然后分別用pH 6.0的50%、60%、70%、80%、95%的乙醇溶液以2 mL/min的流速洗脫，收集乙醇洗脫液，并濃縮定容至100 mL。通過考察洗脫液中檸檬苦素含量，確定其最佳洗脫液pH值。

1.3.4.5 解吸流速的確定

將已經(jīng)預(yù)處理好的樹脂10 g用濕法裝柱，將柑橘檸檬苦素提取液配成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，pH值為7，上樣10 mL，用蒸餾水以1 mL/min流速沖洗。然后分別用80%的乙醇溶液（pH 6）以1、2、3、4 mL/min速率洗脫，收集乙醇洗脫液，并濃縮定容至100 mL。通過考察洗脫液中檸檬苦素含量，確定其最佳解吸流速。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)都是3 次獨(dú)立重復(fù)實驗的結(jié)果，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1檸檬苦素HPLC測定

檸檬苦素的檢測方法有多種，包括分光光度法［20］、薄層色譜法［21］、HPLC法［22-23］等。在前期研究中，本課題組通過實驗探索與考察，確定了本實驗檸檬苦素含量的HPLC分析檢測方法，并以此對湖南省多個不同柑橘品種果實中檸檬苦素的含量進(jìn)行了定量分析［24］。此方法加標(biāo)回收率為92.84%～99.71%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.55%～1.19%，精密度、重現(xiàn)性良好，其最低檢測質(zhì)量濃度為0.25 ng/mL。此方法方便快捷，分離效果較好，適用于柑橘檸檬苦素的檢測分析。

2.2樹脂篩選

表1　不同樹脂對類檸檬苦素吸附和解吸效果Table1　Comparison of adsorption and desorption efficiencies of different macroporous resins for citrus limonin

大孔樹脂由于其理化性質(zhì)不同對吸附分離的影響很大，而不同物質(zhì)在樹脂中的吸附和解吸效果也會有較大差別［25］。綜合評價所選的7 種大孔樹脂（表1）可知，D101樹脂對樣品提取液中類檸檬苦素的吸附效果較好，解吸率為88.98%，而吸附率有85.79%。而DM130樹脂雖然解吸率最高，但是其吸附效果并不理想。由于D101樹脂對檸檬苦素粗提液中的檸檬苦素的吸附率和解吸率較高，故確定D101樹脂為分離純化柚皮黃酮的最佳樹脂。

2.3分離純化柑橘檸檬苦素方法的確定

2.3.1 pH值對柑橘檸檬苦素吸附和解吸的影響

圖1　提取液pH值對D101樹脂吸附率的影響Fig.1　Influence of sample pH on the adsorption capacity of D101

提取液pH值對D101樹脂吸附率有較大影響，且較酸性或較堿性條件下檸檬苦素的吸附率都不高，而接近中性時，樹脂吸附率達(dá)到最大（圖1）。隨著pH值的升高，D101樹脂的吸附率呈先增后減的趨勢，當(dāng)pH 7時，吸附率則達(dá)到了80%以上，說明提取液處于pH值中性條件下，吸附效果最佳。因此確定其最佳的上樣提取液pH 7。

圖2　解吸液pH值對D101樹脂解吸率的影響Fig.2　Influence of desorbent pH on the desorption capacity of D101

提取液pH值對樹脂吸附率存在影響，解吸液pH值對已吸附樹脂的洗脫同樣存在較大影響（圖2）。隨著pH值的升高，雖然整體趨勢也是先增后減，但當(dāng)洗脫液pH 6時，其樹脂解吸率最大。因此選擇解吸液pH 6作為最佳解吸pH值。

2.3.2上樣質(zhì)量濃度對D101大孔樹脂吸附的影響

圖3　上樣質(zhì)量濃度對樹脂吸附量的影響Fig.3　Influence of sample concentration on the adsorption capacity of D101

如圖3所示，隨著上樣質(zhì)量濃度的增加，其D101樹脂吸附量隨之增加，說明D101大孔樹脂吸附承載能力較高。當(dāng)上樣質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL時，其吸附量達(dá)到最大值，而之后質(zhì)量濃度增加其吸附量反而減小，說明其上樣質(zhì)量濃度已經(jīng)超過了樹脂承載范圍，上樣液處理量減少。因此，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，其樹脂吸附能力發(fā)揮最大作用，此時為最佳上樣質(zhì)量濃度。

2.3.3上樣流速對D101大孔樹脂吸附影響

圖4　上樣流速對樹脂吸附量的影響Fig.4　Influence of sample loading flow rate on the adsorption capacity of D101

如圖4所示，隨著上樣流速的增加，其D101樹脂吸附量越來越小。上樣流速在0.5～1 mL/min期間，其樹脂吸附量下降并不明顯，之后其吸附量下降幅度較大。為了縮短實驗周期，故選擇上樣流速為1 mL/min為最佳上樣流速。

2.3.4洗脫醇體積分?jǐn)?shù)對洗脫效果影響

圖5　洗脫醇體積分?jǐn)?shù)對解吸率的影響Fig.5　Influence of alcohol concentration on the desorption rate of D101

如圖5所示，隨著洗脫醇體積分?jǐn)?shù)的增加，其解吸率隨之增高。在洗脫醇體積分?jǐn)?shù)為80%的時候，解吸率達(dá)到了86.3%，隨后其解吸率下降。說明較低和過高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液洗脫效果不佳。因此，選用80%乙醇溶液作為最佳洗脫液。

2.3.5洗脫流速對洗脫效果的影響

圖6　洗脫流速對解吸率的影響Fig.6　Influence of elution flow rate on the desorption rate of D101

如圖6所示，隨著洗脫流速的增加，其解吸效果下降，這說明在洗脫流速低的情況下，吸附樹脂作用越好，并且洗脫更完全。當(dāng)洗脫流速為1 mL/min時，其解吸率為84.1%，而在洗脫流速等于2 mL/min時，其解吸率仍然有75.6%，而隨著洗脫流速的增加，其解吸率都低于50%。同時，考慮實驗周期、時間等因素，綜合提高檸檬苦素大孔樹脂純化效率，因此選用2 mL/min的流速作為最佳洗脫流速。

2.4檸檬苦素純化結(jié)果

根據(jù)以上因素的考察結(jié)果，在本實驗中，將已經(jīng)預(yù)處理好的D101樹脂10 g，采用濕法裝柱，pH 7上樣質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，以1 mL/min的流速上樣10 mL，再用pH 6的80%乙醇溶液在2 mL/min的解吸流速條件下洗脫，進(jìn)行實驗，收集80%乙醇洗脫液，并在55 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用色譜純乙腈定容至10 mL。其粗提取液通過大孔樹脂采用上述方法得到D101樹脂的吸附率為88.53%，解吸率為93.47%，經(jīng)過純化后檸檬苦素含量達(dá)到了92.79%，其純度為2.56%。

3　結(jié) 論

本研究通過對7 種樹脂進(jìn)行檸檬苦素大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸實驗，發(fā)現(xiàn)D101和DM130大孔樹脂有較好的靜態(tài)吸附和解吸效率，通過綜合考察吸附與解吸率，實驗選擇了D101大孔樹脂進(jìn)行檸檬苦素的分離純化。確定D101大孔吸附樹脂的最佳純化條件為：吸附時提取液pH 7、解吸時解吸液pH 6、上樣流速1 mL/min、上樣質(zhì)量濃度0.5 mg/mL、洗脫流速2 mL/min、洗脫液為體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液、用量240 mL。通過樹脂回收重復(fù)使用，發(fā)現(xiàn)D101樹脂通過再生處理后，其吸附性能未有明顯降低，可以重復(fù)使用。采用上述方法得到D101樹脂對檸檬苦素的吸附率為88.53%，解吸率為93.47%，得率為82.75%，HPLC檢測可知，檸檬苦素的含量達(dá)到了92.79%。

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Separation and Purification of Citrus Limonin by Macroporous Resin

PANG Li， DENG Ziniu， LIU Jikai， WANG Rencai*
（College of Gardening and Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

A method for the purifi cation of limonin from citrus by macroporous resin was proposed. The results showed that D101 resin was the best adsorbent for the purifi cation of citrus limonin. The optimal purifi cation conditions were achieved by loading the sample containing 0.5 mg/mL limonin onto the column at a fl ow rate of 1 mL/min and subsequently eluting the adsorbed limonin with 80% alcohol at pH 6 at a fl ow rate of 2 mL/min. The adsorption capacity of D101 resin remained almost unchanged after several cycles of repeated use and regeneration. Under the optimized conditions， the adsorption rate，desorption rate and yield of limonin were 88.53%， 93.47% and 82.75%， respectively. The result of HPLC showed that the limonin content （i.e.， purity） of the purifi ed product was 92.79%.

citrus； limonin； D101 macroporous resin； separation； purifi cation

TS201.1

A

1002-6630（2015）14-0024-05

10.7506/spkx1002-6630-201514005

2014-12-01

教育部創(chuàng)新團(tuán)隊項目（IRT0963）；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)校青年基金項目（13QN18）

龐立（1980—），女，實驗師，博士研究生，研究方向為果樹學(xué)。E-mail：julinomber2@sina.com

王仁才（1962—），男，教授，博士，研究方向為果樹學(xué)。E-mail：wangrenc@163.com