蜂毒注射液對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡影響的研究

譚寧，王科澎，賀守第，羅曉光，朱輝軍，黃勝光

1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳南山醫(yī)院中醫(yī)風(fēng)濕科，廣東 深圳 518052 2.深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 508060 3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410006

蜂毒注射液對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡影響的研究

譚寧1，王科澎2，賀守第3，羅曉光1，朱輝軍1，黃勝光1

1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳南山醫(yī)院中醫(yī)風(fēng)濕科，廣東 深圳 518052 2.深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 508060 3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410006

目的：探究蜂毒注射液對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS-RA）凋亡的影響。方法：原代培養(yǎng)FLS-RA，MTT法測定蜂毒注射液對細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性作用，hoechst染色法觀察凋亡小體，Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)2周后細(xì)胞向心性排列，呈梭形及三角形。經(jīng)過3～5次傳代，F(xiàn)LS-RA細(xì)胞逐漸純化，以FLS為主（＞95%），體外生長穩(wěn)定。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞排列整齊，向心性排列，呈梭形或三角形，偶見圓形細(xì)胞，細(xì)胞核成卵圓形，居細(xì)胞中央，胞質(zhì)均勻透亮。干預(yù)24 h：各組生存率低于空白對照組（P＜0.05），濃度越高，生存率越低；蜂毒注射液處理48 h：各組生存率低于空白對照組（P＜0.05），濃度越高，生存率越低；同濃度蜂毒注射液處理24 h生存率與48 h比較：48 h組小于24 h組（P＜0.05）。利用ORIGIN 5.0軟件計(jì)算蜂毒注射液的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（16.79±0.13）mg/L。實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組中凋亡小體形態(tài)相似，細(xì)胞核呈致密濃染，顏色發(fā)白，而陰性對照組未見明顯凋亡小體，細(xì)胞核未見固縮的染色質(zhì)。B1區(qū)為細(xì)胞碎片，B2區(qū)為晚期凋亡和死亡的細(xì)胞，B3區(qū)為正常細(xì)胞，B4區(qū)為早期凋亡的細(xì)胞。由于B2區(qū)包含死亡的細(xì)胞，多選擇B4區(qū)比較早期凋亡率。低濃度組蜂毒注射液作用FLS-RA細(xì)胞24 h，早期凋亡率大于空白對照組（P＜0.05）；高濃度組蜂毒注射液早期凋亡率明顯高于空白對照組（P＜0.01），且大于低濃度組（P＜0.05）。結(jié)論：蜂毒注射液可誘導(dǎo)成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡，這可能是蜂毒治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)理之一。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）；蜂毒注射液；成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS-RA）；細(xì)胞凋亡

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheum atoid arthritis，RA）是以對稱性多關(guān)節(jié)腫痛為主要臨床表現(xiàn)的一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥、關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞、關(guān)節(jié)畸形及功能喪失為主要病理表現(xiàn)。臨床表現(xiàn)為對稱性多關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、晨僵以及全身多系統(tǒng)的受累，此病病因未明，具有發(fā)病率高、致殘率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了患者的勞動(dòng)力及生活質(zhì)量［1～2］。蜂毒對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人具備較好的療效，但蜂毒通過何種機(jī)制起作用很少有人探究，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS-RA）增生特點(diǎn)類似于腫瘤細(xì)胞增生特點(diǎn)，蜂毒可通過多條途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，故設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)探究蜂毒對FLS-RA凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本取材 4例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜標(biāo)本均取自深圳市第六人民醫(yī)院骨科行關(guān)節(jié)置換或關(guān)節(jié)鏡手術(shù)患者，所有RA患者診斷均符合2009年ACR/EULA制定的RA分類標(biāo)準(zhǔn)和評分系統(tǒng)，得分均＞6分。

1.2 儀器和試劑 恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀（美國beckm an coulter公司）、蜂毒注射液（長春博奧生物有限公司）、胎牛血清（美國Sigm a公司）、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone公司）、MTT試劑盒（碧云天公司）、hoechst試劑盒（碧云天公司）、Annexin V/PI試劑盒（invitrogen公司）、細(xì)胞凋亡陽性對照試劑盒（碧云天公司）。

1.3 成纖維樣滑膜細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將術(shù)后RA滑膜組織放入盛有DMEM/F12培養(yǎng)基的15m L離心管內(nèi)低溫保存，除去附著的脂肪組織及血塊，用預(yù)冷PBS液沖洗3次，將組織塊修剪成1mm×1mm×1mm的小塊，放置于培養(yǎng)瓶中，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)基，觀察滑膜細(xì)胞生長情況，待成纖維樣滑膜細(xì)胞長滿至覆蓋瓶底細(xì)胞＞80%，進(jìn)行傳代，一般采用一傳二。將3～5代的細(xì)胞在倒置光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行鑒定及實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT檢測實(shí)驗(yàn) 蜂毒濃度配置參照臨床蜂毒注射液濃度稀釋于DMEM/F12完全培養(yǎng)基中。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)置空白對照組、低濃度組（0.1m g/L，0.5m g/L，1m g/L）、中濃度組（2 m g/L，4 m g/L，8 m g/L）、高濃度組（16 m g/L，20 m g/L，25m g/L），每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，首先加入100 μL細(xì)胞混懸液（FLS-RA細(xì)胞數(shù)5×104/m L），細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，吸除培養(yǎng)基，加入100μL上述濃度配置的蜂毒注射液培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，加入100μLMTT液，培養(yǎng)箱孵育4 h，再加入100μL甲瓚溶解液，培養(yǎng)箱孵育4 h后，在酶標(biāo)儀下采用570mm波長測定吸光度。

1.5 hoechst染色法觀察凋亡小體 實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對照組、實(shí)驗(yàn)組（根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)的半數(shù)抑制濃度確定蜂毒注射液濃度16 m g/L）、陽性對照組。將蓋玻片放置于6孔板中，每孔加入2 m L細(xì)胞混懸液（FLS-RA細(xì)胞數(shù)1×104/m L），顯微鏡下觀察細(xì)胞爬片成功后，分別加入完全培養(yǎng)基、16m g/L蜂毒注射液培養(yǎng)基、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑A+B，放入培養(yǎng)箱孵育24 h，吸除玻片表面培養(yǎng)基，加入0.5m L固定液，室溫固定10m in，無菌PBS沖洗2次，滴入適量Hoechst染色液染色9 m in，無菌PBS沖洗2次，封片液封片，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6 Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率 根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳濃度，設(shè)置低濃度組（4 m g/L），高濃度組（16 m g/L），空白對照組（完全培養(yǎng)基）。6孔培養(yǎng)板每孔加入1m L細(xì)胞重懸液（FLS-RA細(xì)胞數(shù)5×104個(gè)/m L）中。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)依次加入蜂毒注射液培養(yǎng)基混懸液，孵育24 h，無菌PBS沖洗兩次，胰酶消化后轉(zhuǎn)移至流式管中，離心去上清，無菌PBS沖洗1次，加入1×AnnexinV重懸，將重懸液稀釋至1×106/m L，各組取100μL至流式管中，同時(shí)加入5μLAlexa Fluor 488 Annexin V和1μL 100μg/m LPI工作液，室溫孵育15m in，離心去上清后，加入1X Annexin V定容至500μL，細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 FLS原代培養(yǎng)及鑒定 組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)2周后細(xì)胞向心性排列，呈梭形及三角形。經(jīng)過3～5次傳代，F(xiàn)LS-RA細(xì)胞逐漸純化，以FLS為主（＞95%），體外生長穩(wěn)定。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞排列整齊，向心性排列，呈梭形或三角形，偶見圓形細(xì)胞，細(xì)胞核成卵圓形，居細(xì)胞中央，胞質(zhì)均勻透亮。

2.2 各組OD值比較 見表1。干預(yù)24 h：各組生存率低于空白對照組（P＜0.05），濃度越高，生存率越低；蜂毒注射液處理48 h：各組生存率低于空白對照組（P＜0.05），濃度越高，生存率越低；同濃度蜂毒注射液處理24 h生存率與48 h比較：48 h組小于24 h組（P＜0.05）。利用ORIGIN 5.0軟件計(jì)算蜂毒注射液的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（16.79±0.13）m g/L。

表1 各組OD值比較±s）

表1 各組OD值比較±s）

與空白對照組比較，①P＜0.05；與同組24 h比較，②P＜0.05

組別空白對照組低濃度組低濃度組低濃度組中濃度組中濃度組中濃度組高濃度組高濃度組高濃度組蜂毒注射液濃度（mg/L）0 0.1 0.5 OD值1 2 4 8 16 20 25 24 h 0.0291±0.0015 0.0279±0.0020①0.0261±0.0019①0.0248±0.0017①0.0232±0.0019①0.0194±0.0013①0.0174±0.0017①0.0153±0.0206①0.0093±0.0020①0.0038±0.0011①48 h 0.0312±0.0012 0.0266±0.0016 0.0244±0.0020①②0.0232±0.0019①②0.0180±0.0010①②0.0154±0.0015①②0.0121±0.0012①②0.0074±0.0151①②0.0016±0.0012①②0.0008±0.0009①②

2.3 hoechst染色觀察凋亡小體 見圖1。實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組中凋亡小體形態(tài)相似，細(xì)胞核呈致密濃染，顏色發(fā)白，而陰性對照組未見明顯凋亡小體，細(xì)胞核未見固縮的染色質(zhì)。

圖1 hoechst染色觀察凋亡小體

2.4 各組細(xì)胞凋亡率比較 見圖2。B1區(qū)為細(xì)胞碎片，B2區(qū)為晚期凋亡和死亡的細(xì)胞，B3區(qū)為正常細(xì)胞，B4區(qū)為早期凋亡的細(xì)胞。由于B2區(qū)包含死亡的細(xì)胞，多選擇B4區(qū)比較早期凋亡率。低濃度組蜂毒注射液作用FLS-RA細(xì)胞24 h，早期凋亡率大于空白對照組（P＜0.05）；高濃度組蜂毒注射液早期凋亡率明顯高于空白對照組（P＜0.01），且大于低濃度組組（P＜0.05）。

圖2 各組細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

RA是以對稱性多關(guān)節(jié)損害的一種自身免疫性疾病，其病理表現(xiàn)為滑膜組織異常增生?；そM織是包裹在關(guān)節(jié)外面的一層膜組織，正常的滑膜組織在解剖學(xué)上可分為兩個(gè)部分：滑膜內(nèi)層（襯里層）和滑膜下層（襯里下層），滑膜內(nèi)層介于滑膜下層與滑液之間，這層有兩種主要類型的細(xì)胞：巨噬樣細(xì)胞（又稱A型滑膜細(xì)胞）和成纖維樣細(xì)胞（又稱B型滑膜細(xì)胞）［3～4］。大量的研究證實(shí)，F(xiàn)LS-RA擁有超常的增殖能力以及高強(qiáng)度的侵蝕力，襯里層的滑膜細(xì)胞異常增生可能與細(xì)胞凋亡受到不同程度的抑制相關(guān)［5～6］。

蜂毒是經(jīng)受長時(shí)期考驗(yàn)的天然藥物，在風(fēng)濕病的治療中占有重要地位［7］。藥理研究表明，蜂毒具備鎮(zhèn)痛、抗炎、降血壓、抗凝血、抗菌、防輻射、抗腫瘤等作用。近年來用于治療自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病等。臨床試驗(yàn)研究表明，蜂毒有抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用，可改善類風(fēng)濕因子、血沉、C-反應(yīng)蛋白、抗環(huán)瓜氨酸抗體等指標(biāo)［8～11］。體外研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蜂毒可以有效抑制大鼠體內(nèi)多種細(xì)胞因子的水平，這對抑制滑膜組織炎癥和阻斷關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解有正面作用，進(jìn)而起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用［12～14］。

本實(shí)驗(yàn)通過蜂毒注射液作用于體外原代培養(yǎng)的FLS，MTT實(shí)驗(yàn)顯示在一定范圍內(nèi)［（0.1～25）m g/L］隨著蜂毒注射液濃度升高，F(xiàn)LS的的生存率逐漸下降，通過hoechst染色法可觀察到凋亡小體，利用AnnexinV/PI雙染法聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)蜂毒注射液誘導(dǎo)FLS-RA凋亡，且高劑量組的早期凋亡率大于低劑量組以及陰性對照組。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽是蜂毒治療RA的活性成分［15］，是否蜂毒通過蜂毒肽而誘導(dǎo)FLS的凋亡有待進(jìn)一步探究。

［1］Liu AL，Shen PW，Chen PJ.Strontium ranelate in fracture healing and joint pain im provem ent in arheum atoid arthritis patient［J］.Clin Cases M iner Bone Metab，2013，10（3）：206-209.

［2］Karlson EW，Deane K.Environm ental and geneenvironm ent interactions and risk of rheum atoid arthritis［J］.Rheum Dis Clin North Am， 2012， 38（2）：405-426.

［3］Ospelt C， Neidhart M， Gay RE， et al.Synovial activation in rheum atoid arthritis ［J］.Frontiers in Bioscience，2004，9：2323-2334.

［4］ M elinte R，Jung I，Georgescu L，et al.VEGF and CD31 expression in arthritic synovium and cartilage of hum an knee joints［J］.Rom J Morphol Em bryol，2012，53（4）：911-915.

［5］W ang F， Xu L， Feng X， et al.Interleukin-29 m odulates proinflamm atory cytokine production in synovialinflamm ation of rheum atoid arthritis［J］.Arthritis Research&Therapy，2012，14（5）：R228.

［6］ Fan W，Zhou ZY，Huang XF，et al.Deoxycytidine kinase prom otes the m igration and invasion of fibroblast-like synoviocytes from rheum atoid arthritis patients ［J］.International Journal of Clinical and Experim entalPathology，2013，6（12）：2733-2744.

［7］黃勝光，譚寧，朱輝軍.雷公藤、附子、蜂毒在風(fēng)濕病中的應(yīng)用［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（6）：20-22.

［8］張金祿，劉喜德.蜂針療法治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)滑膜炎的臨床隨機(jī)對照研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（8）：1904-1906.

［9］鄧鳴，張煒寧.蜂針療法治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎20例臨床觀察［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，14（6）：71-73.

［10］馬輝，袁敏哲，姚卓.蜂療對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2012，39（6）：1063-1064.

［11］劉喜德，張金祿，鄭漢光，等.蜂針療法對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血TNF-α、IL-1β的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（5）：996-997.

［12］趙爭敏，薛鸞，曹瑤.蜂毒對膠原誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎IL-1β、TNF-α、PGE2的影響［J］.河南中醫(yī)，2009，29（12）：1169-1170.

［13］周穎芳，段穎華，李萬瑤.蜂針對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠HPA軸的影響［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14（4）：233-235.

［14］楊順益，劉金芝.馮淑蘭.等.蜂針對實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物細(xì)胞因子影響的研究［J］.中國自然醫(yī)學(xué)雜志，2002，4（1）：41-43.

［15］李晶華，馬靜，李軍昌.蜂毒肽對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠患側(cè)關(guān)節(jié)的影響［J］.武警醫(yī)學(xué)，2011，22（9）：741-743.

（責(zé)任編輯：駱歡歡）

Study o f Ap istoxin In jection on Apop tosis o f Fib rob last-like Synovial Cells o f Rheum atoid Arth ritis Patien ts

TAN Ning，WANG Kepeng，HE Shoudi，et al

Objective：To explore the influence of Apistoxin injection on the apoptosis of fibroblast-like synovial cells of rheum atoid arthritis patients.M ethods：Rheum atoid arthritis fibroblast-like synovial cells（FLS-RA）w as concentrated by the prim ary culture in vitro.Effect of Apistoxin injection on cellproliferation and cell toxicity w as m easured by MTT technique，and apoptotic body w as observed by Hoechst staining，apoptotic rate w as detected after Annexin V/PIdouble staining.Results：After prim ary culture for2 w eeks，the cells w ere fusiform or triangle-like，arranged around the center.After passage culture for 3-5 generations，F(xiàn)LS-RA becam e pure and the percentage of FLSw as over 95%，grow ing steady in vitro.The results under inverted phase contrast m icroscope show ed that the cells w ere arranged around the center in order，w ere fusiform or triangle-like，and seldom w ere round w ith oval nucleus in the center of the cell.The cytoplasm w as w ell-distributed and lucency.After intervention w ith Apistoxin injection for24 and 48 hours，the survival rate of FLS-RAw as low er in the intervention groups than that in the blank control group（P＜0.05），and the survival rate decreased w ith the increase of Apistoxin injection concentration（P＜0.05）.The survival rate induced by the sam e concentration of Apistoxin injection w as low erafter intervention for 48 hours than that after 24 hours（P＜0.05）.The 50%inhibiting concentration（IC50）of Apistoxin injection w as 16.79±0.13m g/L. The apoptotic body w as found in both observation group and positive controlgroup，w hile w as not show n in the negative control group.The cells in B4 region w ere chosen for the calculation of early apoptotic rate，and the results show ed that low-andhigh-concentration Apistoxin injection groups had higherearly apoptotic rate than the blank controlgroups（P＜0.05 or P＜0.01），and the high-concentration groups had the highestearly apoptotic rate（P＜0.05）.Conclusion：Apistoxin injection can induce the apoptosis of fibroblast-like synovial cells，w hich m ay be one of the therapeutic m echanism s of Apistoxin injection for rheum atoid arthritis.

Rheum atoid arthritis；Apistoxin injection；Fibroblast-like synovialcells；Apoptosis.

R593.22

A

0256-7415（2015）06-0280-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.06.130

2014-12-29

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201303177）

譚寧（1977-），女，副主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕病。

黃勝光，E-mail：282111306@qq.com。