蕹菜過氧化物酶的分離純化及理化性質(zhì)

王紅揚(yáng)，王 潔，李 星，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

蕹菜過氧化物酶的分離純化及理化性質(zhì)

王紅揚(yáng)，王 潔，李 星，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

新鮮蕹菜經(jīng)硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析和Superdex-200凝膠過濾層析后獲得電泳純的過氧化物酶（peroxidase，POD），該酶的比活力、回收率、純化倍數(shù)和產(chǎn)率分別為35 972.96 U/mg、12.21%、168.48和211.07 U/g。該酶的亞基分子質(zhì)量為42.7 kD，最適溫度為40 ℃，最適pH值為 6，并且在20～50 ℃及pH 5～8的范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。以不同濃度的H2O2為底物，測得該酶的Km值為18.32 mmol/L。NaCl、尿素（Urea）、Zn2+、Mg2+對該酶都具有較強(qiáng)的激活作用，十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、硫氰化鉀（potassium thiocyanate，KSCN）、抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、Ba2+、Mn2+、Fe2+、甲醇、乙醇、正丁醇和異丙醇對蕹菜POD活力均有抑制作用，其中抗壞血酸對POD有極強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)濃度為0.01 mol/L時(shí)，酶活力接近于0。

蕹菜；過氧化物酶；分離純化；酶活力

過氧化物酶（peroxidase，POD）是一類在生物體內(nèi)普遍存在的、由單一肽鏈和鐵卟啉組成的血紅蛋白類氧化酶，它催化由H2O2參與的氧化反應(yīng)，例如參與胺類和酚類化合物的氧化反應(yīng)。POD在生物體內(nèi)發(fā)揮多種重要功能，例如參與分解吲哚乙酸［1］、合成木質(zhì)素［2］和植物體內(nèi)防御反應(yīng)［3］。當(dāng)今，該酶不僅被廣泛用于免疫印跡［4］、酶聯(lián)反應(yīng)［5］和電鏡技術(shù)［6］等生物學(xué)研究，而且在污水處理［7］、生物傳感器［8］等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

目前，該酶商品化生產(chǎn)的主要原料是辣根，但是辣根生長條件嚴(yán)格，我國種植量少，主要靠進(jìn)口，因此價(jià)格昂貴。目前雖然已有從韭菜［9］、枇杷［10］、蓮藕［11］、甘薯葉［12］、荔枝果皮［13］、苦瓜［14］等植物中分離純化該酶的相關(guān)報(bào)道，但是從廉價(jià)來源的植物中篩選出富含POD的樣品，并希望在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中提高產(chǎn)量、降低成本的研究迄今鮮有報(bào)道。蕹菜，又稱空心菜（Ipomoea aquatica Forsk.），不但在我國華南、華中、華東和西南各地普遍栽種，而且相對于其他植物，例如韭菜、芒果、洋蔥、苦瓜等，可持續(xù)收割、價(jià)格低廉、畝產(chǎn)高達(dá)5 000 kg，是生產(chǎn)廉價(jià)POD的理想材料。因此，本實(shí)驗(yàn)以蕹菜為材料對POD進(jìn)行分離純化并且對其部分性質(zhì)進(jìn)行研究，為POD的生產(chǎn)提供新的原料和方法，同時(shí)為其應(yīng)用于食品工業(yè)、環(huán)境保護(hù)及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮蕹菜購于重慶市北碚區(qū)文星灣永輝超市。

DEAE-Sepharose、Superdex-200、分子排阻層析標(biāo)準(zhǔn)樣品、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 美國GE公司；Tris 香港Farco公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 美國Fluka公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

AKTA prime plus蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國GE公司；冷凍干燥儀 德國Uni Equip公司；Milli-Q plus超純水儀美國Millipore公司；垂直板電泳槽和電泳儀 美國Bio-Rad公司；UV-2550型分光光度計(jì) 日本島津公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀公司；精密電子天平、SevenEasy精密pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3方法

1.3.1粗酶液的提取

取新鮮蕹菜，洗凈晾干后稱質(zhì)量，按照1：3（m/V）的比例加入預(yù)冷的0.05 mol/L pH 7.5的磷酸鹽緩沖液，勻漿后于4 ℃靜置抽提3 h。4 ℃、10 000 r/min離心兩次，每次30 min，收集上清液，得到粗酶液。

1.3.2硫酸銨分級沉淀

在攪拌的同時(shí)向粗酶液中緩慢加入研磨后的干燥硫酸銨到20%飽和度，4 ℃條件下鹽析2 h，12 000 r/min離心30 min收集上清液；再向所得上清液緩慢加入硫酸銨至60%飽和度，4 ℃條件下鹽析2 h，12 000 r/min離心30 min后向沉淀中加入提取緩沖液使沉淀充分溶解；4 ℃透析除鹽過夜，即可得到初步純化的POD酶液。

1.3.3DEAE-Sepharose層析

經(jīng)0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液平衡柱子后，取10 mL粗酶液上柱，用0～1 mol/L NaCl（pH7.5的磷酸鹽緩沖液配制）進(jìn)行線性梯度洗脫，流速設(shè)定為0.5 mL/min，每管收集4 mL；測定各管蛋白質(zhì)含量及其酶活性，收集活性相對較高的酶液，經(jīng)透析脫鹽后，冷凍干燥保存。

1.3.4Superdex-200層析

1.3.3節(jié)所得的凍干酶用提取緩沖液溶解，取5 mL上樣于Superdex-200層析柱，用提取緩沖液洗脫，流速為0.5 mL/min，每管收集4 mL，測定各管蛋白質(zhì)含量及其酶活性，收集活性相對較高的酶液，透析脫鹽后，冷凍干燥后于-20 ℃條件下保存。

1.3.5POD活力的測定

參考Chen等［15］的方法。反應(yīng)體系為3 mL，包括2.775 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）、0.1 mL 1% H2O2、0.1 mL 4%愈創(chuàng)木酚和0.025 mL酶液。操作過程如下：在加入底物和緩沖液后，再加入0.025 mL酶液并混勻，在25 ℃條件下記錄2 min內(nèi)每分鐘光密度（OD470nm）值的變化值。以測定條件下每分鐘光密度值變化0.01所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.6蕹菜POD純度鑒定與分子質(zhì)量測定［16］207-223

采用SDS-PAGE進(jìn)行純度鑒定，其中分離膠為12%，濃縮膠為5%，加樣量為20 μL。經(jīng)SDS-PAGE和凝膠過濾層析分別測定該酶亞基分子質(zhì)量與全分子質(zhì)量。

1.3.7蛋白質(zhì)濃度的測定

分別用紫外分光光度法與Bradford法［16］171-176測定。

1.3.8蕹菜POD性質(zhì)的研究

1.3.8.1最適溫度和熱穩(wěn)定性的測定

分別在不同溫度（20～80 ℃，相差5 ℃）下測定酶活力，確定最適溫度，在此條件下酶活力為100%；將酶液放置于不同溫度（20～70 ℃，相差10 ℃）下保存，每隔1 h測定相對酶活力（以25 ℃條件下的酶活力為100%）。

1.3.8.2最適pH值和pH值穩(wěn)定性的測定

在pH 3～8條件下測定酶的活力，以確定最適pH值（酶活力為100%）；將酶液放置于pH 3～8條件下保存，每隔1 h測定酶活力（以pH 7.0時(shí)測得的酶活力作為100%）。

1.3.8.3米氏常數(shù)（Km）的測定

以不同濃度的H2O2（10～50 mmol/L）為底物，在酶活力測定條件下（25 ℃、pH 7.0），測得蕹菜POD的酶活力。采用雙倒數(shù)作圖（Lineweaver-Burk）法［17］233-234求得該酶的Km值。

1.3.8.4有機(jī)溶劑對POD活性的影響

分別將甲醇、乙醇、正丁醇、異丙醇4 種有機(jī)溶劑與緩沖液混合，混合后體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%，之后再與酶液混合，25 ℃條件下作用30 min，加入底物后，測定酶活力（以不加有機(jī)溶劑的酶活力為100%）。

1.3.8.5部分化合物對POD活性的影響

分用將NaCl、抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、SDS、硫氰化鉀（potassium thiocyanate，KSCN）、尿素（Urea）5 種化合物配制成100 mmol/L母液，再按相應(yīng)比例分別與緩沖液及酶液混合（終濃度分別達(dá)到為10、20、30、40、50 mmol/L），置于25 ℃條件下作用30 min，之后再加底物測定POD活力（以不加化合物時(shí)的酶活力為100%）。

1.3.8.6部分金屬離子對POD活性的影響

在酶活力測定體系中加入一定的0.1 mol/L金屬離子，得到不同終濃度的金屬離子（0.01～0.05 mol/L）體系，隨后加入0.025 mL酶液，置于25 ℃條件下作用30 min，加入底物，測定酶活力（以不加金屬離子的酶活力為100%）。

2　結(jié)果與分析

2.1蕹菜POD的分離純化結(jié)果

圖1　蕹菜POD的DEAE-Sepharose層析圖Fig.1 DEAE-Sepharose chromatography of POD from Ipomoea aquatica Forsk.

圖2　蕹菜POD的Superdex-200層析圖Fig.2 Superdex-200 chromatography of POD from Ipomoea aquatica Forsk.

表1　蕹菜POD的分離純化效果Table1 Isolation and purification of POD from Ipomoea aquatica Forsk.

蕹菜POD粗酶液經(jīng)DEAE-Sepharose層析后，結(jié)果如圖1所示，蛋白質(zhì)含量最高的是第11管，而酶活力最高的是第18管，通過該步驟有效地去除了雜蛋白，純化了目的蛋白。經(jīng)DEAE-Sepharose層析所得樣品通過Superdex-200分子排阻層析，結(jié)果如圖2所示，蛋白質(zhì)含量較高的是第22和第47管，而酶活力最高的是第34管，目的蛋白與雜蛋白得到有效分離。經(jīng)SDS-PAGE為單一條帶（圖3），說明該酶達(dá)到了電泳純。該酶的分離純化結(jié)果見表1，蕹菜POD的純化倍數(shù)為168.48，回收率為12.21%，比活力為35 972.96 U/mg，產(chǎn)率為211.07 U/g。

2.2蕹菜POD分子質(zhì)量測定結(jié)果

SDS-PAGE測得該酶的亞基分子質(zhì)量為42.7 kD（圖3），經(jīng)Superdex-200凝膠過濾層析測得該酶的全分子質(zhì)量約為43 kD，由此可以判定蕹菜POD由單一亞基構(gòu)成。

圖3　蕹菜POD的SDS-PAGGEE圖Fig.3 SDS-PAGE of purified POD from Ipomoea aquatica Forsk.

2.3蕹菜POD的理化性質(zhì)

2.3.1最適溫度和熱穩(wěn)定性

圖4　溫度對蕹菜POD活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk.

圖5　蕹菜POD的熱穩(wěn)定性Fig.5 Effect of temperature on the stability of POD from Ipomoea aquatica Forsk.

由圖4可知，蕹菜POD的最適反應(yīng)溫度為40 ℃。由圖5可知，蕹菜POD在20～50 ℃之間具有很好的熱穩(wěn)定性，其中在50 ℃條件下保溫5 h后相對酶活力仍可達(dá)到82%；但是在溫度高于60 ℃后，熱穩(wěn)定性迅速降低，相對酶活力喪失高達(dá)60%以上，之后維持在低酶活性狀態(tài)。

2.3.2最適pH值和pH值穩(wěn)定性

圖6　pH值對蕹菜POD活力的影響Fig. 6 Effect of pH on the activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk.

圖7　蕹菜POD的pH值穩(wěn)定性Fig.7 pH Stability of POD from Ipomoea aquatica Forsk.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蕹菜POD的最適pH值為6（圖6），在pH 5～7范圍內(nèi)均能保持90%以上活性；蕹菜POD在pH 5～8范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好，保持5 h后相對酶活力還接近90%。但是，當(dāng)pH值低于4以后，保持1 h，相對酶活力即降低至50%以下，并且隨著時(shí)間延長，酶活力持續(xù)緩慢降低（圖7）。

2.3.3蕹菜POD米氏常數(shù)（Km）的測定結(jié)果

在POD活性測定系統(tǒng)中，用蕹菜POD催化不同濃度（0.02～0.1 mol/L）的過氧化氫與愈創(chuàng)木酚的反應(yīng)，測定蕹菜POD活力。以雙倒數(shù)作圖法求得蕹菜POD的Km值為18.32 mmol/L（圖8），其中v表示酶促反應(yīng)速率。

圖8　雙倒數(shù)法測定蕹菜POD的米氏常數(shù)Fig.8 Determination of Kmof POD from Ipomoea aquatica Forsk. by Lineweaver-Burk plot

2.3.4有機(jī)溶劑對蕹菜POD活性的影響

圖9　甲醇、乙醇、正丁醇、異丙醇對蕹菜POD活力的影響Fig.9 Effects of methanol， ethanol， isopropyl alcohol and n-butyl alcohol on the activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk.

由圖9可知，甲醇、乙醇、正丁醇和異丙醇這4種有機(jī)溶劑對蕹菜POD活力均有抑制作用，并且隨著有機(jī)溶劑濃度的增大，抑制作用不斷增強(qiáng)。其中正丁醇和異丙醇抑制作用較為顯著，乙醇和甲醇抑制作用相對較弱。

2.3.5不同化合物對蕹菜POD活性的影響

圖10　不同化合物對蕹菜POD活力的影響Fig.10 Effects of various compounds on the activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk.

由圖10可知，NaCl、Urea對POD有非常輕微的激活作用，最大激活相對酶活力到106%；SDS、KSCN對POD均有較強(qiáng)的抑制作用，其中當(dāng)SDS濃度為0.05 mol/L時(shí)，相對酶活力不到46%；AsA對POD則有極強(qiáng)的抑制作用，其中當(dāng)濃度僅為0.01 mol/L時(shí)，酶活力就被完全抑制。

2.3.6不同金屬離子對蕹菜POD活性的影響

圖11　不同金屬離子對蕹菜POD活力的影響Fig.11 Effects of metal ions on the activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk.

由圖11可知，Zn2+、Mg2+對蕹菜葉POD明顯的激活作用，并且隨著濃度的增加，激活作用明顯增強(qiáng)，其中Zn2+最大可以使其達(dá)到初始酶活力的211%；Ba2+對蕹菜POD有輕微的抑制作用；Mn2+、Fe2+對蕹菜POD則具有明顯的抑制作用，尤為明顯的是Fe2+在0.01 mol/L時(shí)，相對酶活力只剩下23%，0.02 mol/L時(shí)POD幾乎完全抑制；K+、Ca2+對蕹菜POD作用不明顯。

3　討 論

與從其他植物中分離純化的POD相比較，本實(shí)驗(yàn)研究的蕹菜POD具有以下特點(diǎn)：首先，在我國華南、華中、華東和西南各地普遍栽種，分布范圍廣分布范圍廣、產(chǎn)量高，能能為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供充足原料；其次，材料酶含量高，分離純化步驟簡單，比活力、純化倍數(shù)和單位產(chǎn)量均相對較高，分別達(dá)到35 972.96 U/mg、168.48和211.07 U/g。

蕹菜POD最適溫度為40℃，與女貞果實(shí)［18］、蓮藕［11］、荔枝果皮［13］的POD最適溫度接近，低于甘薯葉POD的60 ℃［12］和棕櫚葉的55 ℃［19］。在20～40 ℃均有很高的穩(wěn)定性，但是當(dāng)溫度過高時(shí)，活性中心遭到破壞，從而酶與底物結(jié)合效率下降，酶活性降低。該酶的最適pH值為6，與辣根［20］相同，在pH 5～8范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，保溫5 h其相對酶活力均保持在90%以上，耐受范圍廣泛，在低pH值條件下，POD失去活性中心必需的亞鐵原卟啉，從而活性降低。大多數(shù)植物的過氧化物酶分子質(zhì)量在30～70 kD范圍內(nèi)，該酶的亞基分子質(zhì)量為42.7 kD，與蓮藕的41.5 kD［11］、紅薯的42 kD［21］、苦瓜的43 kD［22］來源的POD相近，低于木瓜的69.4 kD［23］，高于枇杷果肉的22.6 kD［10］，具有一定的物種差異性。同時(shí)采用愈創(chuàng)木酚為底物，該酶的Km值為18.32 mmol/L，低于豆殼的0.41 mmol/L［24］、紅甜菜的98.61 mmol/L［25］和甘薯葉的291 mmol/L［12］，具有較高的底物親和力。

常見的有機(jī)溶劑、化合物、金屬離子對POD的活性均有不同程度的影響，這是POD的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定的。Halpin等［26］研究表明，鐵離子是POD活性中心的必需成分，即POD是由單一肽鏈與卟啉構(gòu)成的血紅素蛋白，脫輔基蛋白分子必須與血紅素結(jié)合才能構(gòu)成全酶。甲醇、乙醇、異丙醇和正丁醇對該酶均有抑制作用，主要是由于隨著有機(jī)溶劑濃度的不斷增加，破壞了由氫鍵、疏水鍵和范德華力構(gòu)成的極性水化層，POD空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使酶活性降低。KSCN、SDS、AsA對該酶都有顯著的抑制作用，SDS作為一種常見變性劑，能夠破壞蛋白酶分子中的氫鍵和疏水作用，使分子去折疊，破壞空間構(gòu)象，從而導(dǎo)致酶活力下降［17］378-380。而KSCN和AsA均能破壞血紅素亞基，從而使該酶失活［27］。金屬離子對蕹菜POD活性的影響差異較大，其中Zn2+、Mg2+對蕹菜POD有明顯的激活作用，并且隨著濃度的增加，激活作用明顯增強(qiáng)；Mn2+、Fe2+對蕹菜POD則具有明顯的抑制作用，尤為明顯的是Fe2+在0.01 mol/L時(shí)，相對酶活力只剩下23%，而當(dāng)Fe2+濃度達(dá)到0.02 mol/L時(shí)幾乎完全抑制；K+、Ca2+對蕹菜POD作用不明顯。

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Isolation， Purification and Characterization of Peroxidase from Ipomoea aquatica Forsk.

WANG Hongyang， WANG Jie， LI Xing， TANG Yunming*
（Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region， Ministry of Education， Chongqing Sweet-potato Engineering Research Center， School of Life Science， Southwest University， Chongqing 400715， China）

Electrophoresis-purity peroxidase （POD） was extracted and purified from Ipomoea aquatica Forsk. through ammonium sulfate precipitation， DEAE-Sepharose and Superdex-200 chromatography. The specific activity of the purified peroxidase was 35 972.96 U/mg and the yield was 211.07 U/g with a recovery rate of 12.21% and a purification fold of 168.48. Its molecular mass was around 42.7 kD as determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）. Besides， the POD with the optimal temperature and pH of 40 ℃ and 6， respectively， was relatively stable in the temperature range of 20-50 ℃ and pH range of 5-8. This enzyme showed a Kmvalue of 18.32 mmol/L towards the substrate hydrogen peroxide. In addition， the POD was found to be activated by NaCl， urea， Zn2+and Mg2+but inhibited by SDS， KSCN， ascorbic acid （AsA）， Ba2+， Mn2+， Fe2+， methanol， ethanol， n-butyl alcohol and isopropanol， and completely inactivated by 0.01 mmol/L AsA.

Ipomoea aquatica Forsk.； peroxidase； isolation and purification； enzyme activity

Q946.5

A

1002-6630（2015）03-0166-05

10.7506/spkx1002-6630-201503032

2014-03-02

重慶市科委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（CSTC2011AB1027）

王紅揚(yáng)（1987—），男，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：wanghongyang123@hotmail.com

唐云明（1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn