蜂王漿對(duì)雌性大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響

沈 芳，劉振國(guó)，沈 杰，吉 挺*

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

蜂王漿對(duì)雌性大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響

沈 芳，劉振國(guó)，沈 杰，吉 挺*

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

目的：探討高劑量蜂王漿對(duì)雌性大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響。方法：實(shí)驗(yàn)組大鼠按3 g/（200 g·d）（以體質(zhì)量計(jì)，下同）灌胃新鮮的蜂王漿溶液，對(duì)照組按3 mL/（200 g·d）灌胃生理鹽水，4 周后，停止灌胃，繼續(xù)飼養(yǎng)2 周。每?jī)芍芙馄室慌笫?，稱質(zhì)量計(jì)算心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、子宮、卵巢臟器系數(shù)，用放射免疫技術(shù)檢測(cè)血清雌二醇（estradiol，E2）、促卵泡素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體素（luteinizing hormone，LH）、孕激素（progestrone，P）含量，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）檢測(cè)卵巢和子宮中雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）、雌激素受體β（estrogen receptor β，ERβ）、促卵泡素受體（follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）、促黃體素受體（luteinizing hormone recepter，LHR）、孕激素受體（progestrone receptor，PR）mRNA表達(dá)量。結(jié)果：灌胃2 周，實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量、主要臟器系數(shù)、血清主要性激素含量及其卵巢和子宮中受體表達(dá)量與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異；灌胃4 周，實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組血清E2顯著高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組卵巢PR mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組子宮中ERα、ERβ、PR mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組臟器系數(shù)無(wú)顯著差異；停止灌胃2 周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量、主要臟器系數(shù)、血清主要性激素含量與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異，實(shí)驗(yàn)組卵巢中FSHR、ERβ、PR mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組子宮中ERα、ERβ、FSHR和PR mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。結(jié)論：高劑量的蜂王漿在一定程度上影響雌性大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。

蜂王漿；臟器系數(shù)；激素；激素受體

蜂王漿又稱蜂皇漿、王漿、蜂乳，是10～15 日齡哺育工蜂舌腺和上顎腺分泌的呈乳白色或淡黃色的漿狀物，有酸、澀、辛辣、甜并略帶芳香氣味［1］。蜂王漿中的營(yíng)養(yǎng)保健和藥理成分豐富而均衡，具有抗氧化、抗輻射、抗疲勞、抗衰老、提高機(jī)體免疫力［2-4］、提高動(dòng)物繁殖能力［5］及美容養(yǎng)顏［6］多種作用。

隨著人們對(duì)健康生活的追求不斷提高，人們對(duì)功能食品的研究越來(lái)越多。蜂王漿作為世界上少數(shù)可供人類直接食用且具有高活性成分的超級(jí)營(yíng)養(yǎng)食品，日益受到人們的關(guān)注。很多國(guó)家已經(jīng)將蜂王漿開(kāi)發(fā)成商業(yè)產(chǎn)品尤其是作為營(yíng)養(yǎng)食品、化妝品和藥品［6］。有蜂王漿激素檢測(cè)的結(jié)果表明，蜂王漿中的激素是痕量的，并且遠(yuǎn)低于牛羊肉和雞蛋中的激素含量［8-9］。同時(shí)，大量研究表明蜂王漿和女性乳腺癌沒(méi)有關(guān)系［10-12］，目前尚未發(fā)現(xiàn)蜂王漿會(huì)引起女性疾病或者兒童性早熟的報(bào)道。然而，激素替代療法與乳腺癌的相關(guān)性存在爭(zhēng)議，甚至還有人將服用蜂王漿和激素替代療法混為一談［7］；Katayama等［13］發(fā)現(xiàn)部分女性在食用蜂王漿后引起過(guò)敏反應(yīng)；Yang Anshu等［14］的研究顯示大鼠灌胃蜂王漿劑量為800 mg/kg時(shí)，大鼠精子畸形率增加；實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)部分年輕女性口服蜂王漿后會(huì)發(fā)生不良反應(yīng)，以致“蜂王漿會(huì)引發(fā)乳腺癌”的傳言造成消費(fèi)者的疑慮和擔(dān)心，同時(shí)引起人們對(duì)蜂王漿激素效應(yīng)的極大關(guān)注。

本研究以青春期的雌性大鼠為對(duì)象，研究高劑量的蜂王漿對(duì)青春期雌性大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響，血清中雌二醇（estradiol，E2）、促卵泡素（follicle stimulating hormone ，F(xiàn)SH）、促黃體素（luteinizing hormone，LH）、孕激素（progestrone，P）以及卵巢和子宮中雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）、ERβ、促卵泡素受體（follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）、促黃體素受體（luteinizing hormone recepter，LHR）、孕激素受體（progestrone receptor，PR）mRNA表達(dá)的影響，為蜂王漿的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、材料與試劑

48 只8 周齡健康SPF級(jí)雌性大鼠，體質(zhì)量（182±5）g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2012-1101。

新鮮蜂王漿由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)提供。

E2、FSH、LH、P放射免疫試劑盒 北京北方生物科技研究所；焦磷酸二乙酯 美國(guó)Amersco公司；Trizol試劑 美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒 大連寶生物工程有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

r-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀 中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司；ABI System 7500型PCR儀 美國(guó)ABI公司；NanoDrop 1000型分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組和飼養(yǎng)

48 只8 周齡雌性大鼠隨機(jī)分為兩組，分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，按每籠4～5 只飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心開(kāi)放的環(huán)境中，大鼠自由采食、飲水。

實(shí)驗(yàn)組大鼠按3 g/（200 g·d）（以體質(zhì)量計(jì)，下同）灌胃新鮮的蜂王漿溶液，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明低劑量的蜂王漿對(duì)雌性大鼠沒(méi)有顯著影響，因此，本實(shí)驗(yàn)給予大鼠灌胃高劑量蜂王漿，為3 g/（200 g·d），根據(jù)黃娟萍等［15］的換算法換算成人體用量為143 g/（60 kg·d），遠(yuǎn)高于揚(yáng)州大學(xué)蜂王漿3～5 g/（60 kg·d）的推薦用量。對(duì)照組按3 mL/（200 g·d）灌胃生理鹽水。每周稱體質(zhì)量。灌胃4 周后，停止灌胃，繼續(xù)飼養(yǎng)2 周。

1.3.2血清性激素和臟器系數(shù)測(cè)定

分別于大鼠灌胃第15天、第29天和停止灌胃后第15天，每組隨機(jī)取8 只大鼠稱質(zhì)量后，麻醉，動(dòng)脈取血，4 000 r/min離心10 min獲得血清，測(cè)定血清中E2、FSH、LH和P的含量，采血后處死大鼠，迅速取子宮和卵巢稱質(zhì)量后于液氮中速凍，再轉(zhuǎn)入-70 ℃冰箱中保存。同時(shí)分離心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟，剔除組織黏附的脂肪和筋膜，濾紙吸干后稱質(zhì)量，按照下式計(jì)算各器官的臟器系數(shù)。

1.3.3子宮和卵巢激素受體基因mRNA的表達(dá)檢測(cè)

用Trizol提取子宮和卵巢組織的總RNA。引物序列見(jiàn)表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Real-time PCR按TaKaRa說(shuō)明書(shū)操作。

表1　引物序列Table1 Primer sequenceess

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0軟件非配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1蜂王漿對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

圖1　大鼠每周的體質(zhì)量Fig.1 Body weight of rats exposed to royal jelly for different weeks

由圖1可知，大鼠初始體質(zhì)量差異不顯著，灌胃4 周內(nèi)實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量持續(xù)低于對(duì)照組，在灌胃到第3、4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；停止灌胃后（5～6 周），實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量增長(zhǎng)速率明顯增加，停止灌胃1周（第5周）后，實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量和對(duì)照組體質(zhì)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明灌胃高劑量蜂王漿會(huì)影響大鼠體質(zhì)量的增加。

2.2蜂王漿對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響

表2　大鼠的臟器系數(shù)Table2 Organ coefficients in female rats orally given royal jelly

由表2可知，對(duì)灌胃2 周、4 周和停止灌胃2 周后的大鼠各主要臟器的臟器系數(shù)比較，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。表明高劑量蜂王漿對(duì)大鼠臟器系數(shù)沒(méi)有顯著影響。

2.3蜂王漿對(duì)雌性大鼠血清主要性激素水平的影響

表3　蜂王漿對(duì)雌性大鼠血清主要性激素水平的影響Table3 Influence of royal jelly on serum levels of sex hormones in female rats rats

由表3可知，灌胃蜂王漿2 周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠血清主要性激素差異不顯著（P＞0.05）；灌胃蜂王漿4 周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中E2含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其他性激素含量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異不顯著；停止灌胃2 周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中主要性激素含量和對(duì)照組差異不顯著。表明灌胃高劑量蜂王漿4 周可以顯著提高雌性大鼠血清E2的含量。

2.4卵巢和子宮中主要性激素受體基因的相對(duì)表達(dá)量

2.4.1卵巢中性激素受體基因相對(duì)表達(dá)量

圖2　卵巢中性激素受體基因相對(duì)表達(dá)量Fig.2 mRNA expression levels of ERα， ERβ， FSHR， LHR， and PR in the ovary

由圖2可知，大鼠灌胃2 周時(shí)，各主要性激素受體的表達(dá)量和對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）；灌胃4 周，PR mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其他激素受體基因表達(dá)量和對(duì)照組無(wú)顯著差異；停止灌胃2 周，大鼠卵巢主要性激素受體基因的表達(dá)量整體高于對(duì)照組，尤其是ERβ、FSHR和PR mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。表明高劑量蜂王漿對(duì)雌性大鼠卵巢主要性激素受體的表達(dá)量存在一定的影響。

2.4.2子宮中性激素受體基因相對(duì)表達(dá)量

圖3　子宮中性激素受體基因相對(duì)表達(dá)量Fig.3 mRNA expression levels of ERα， ERβ， FSHR， LHR， and PR in the uterus

由圖3可知，大鼠灌胃2 周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組主要性激素受體基因的表達(dá)量和對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）；灌胃4 周，ERα、ERβ、PR mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），LHR、FSHR mRNA表達(dá)量和對(duì)照組無(wú)顯著差異；停止灌胃2 周，實(shí)驗(yàn)組ERα、ERβ、FSHR、PR mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），LHR mRNA表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。表明高劑量的蜂王漿對(duì)雌性大鼠子宮主要性激素受體表達(dá)量有一定影響。

3　結(jié)論與討論

眾多研究結(jié)果表明，低劑量蜂王漿對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)是有利的［16-17］，并且可以顯著提高動(dòng)物的繁殖性能［18-20］，然而實(shí)踐中人們對(duì)蜂王漿的顧慮依然不容忽視。雖然眾多報(bào)道表明蜂王漿不會(huì)引起性早熟［21］，不會(huì)增加女性患乳腺癌以及腫瘤的危險(xiǎn)［22］，但并沒(méi)有消除大眾對(duì)蜂王漿的顧慮。為進(jìn)一步研究蜂王漿對(duì)人體的影響，本研究采用高劑量蜂王漿飼喂大鼠，并對(duì)大鼠體質(zhì)量、臟器系數(shù)、血清性激素含量及其受體基因在卵巢和子宮中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。

灌胃到第3、4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組，可能是由于脂肪沉積減少，這與周明等［23］的研究結(jié)果一致。臟器系數(shù)是評(píng)價(jià)藥物毒理性的基本參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中蜂王漿對(duì)大鼠的臟器系數(shù)無(wú)顯著影響，表明該劑量蜂王漿沒(méi)有毒性，這與前人得出的蜂王漿是安全的及對(duì)人體沒(méi)有毒害作用的認(rèn)識(shí)是一致的［8］。灌胃4 周，大鼠血清各激素只有E2顯著升高，停止灌胃2 周后，血清中各激素含量恢復(fù)正常，表明持續(xù)灌胃蜂王漿對(duì)大鼠造成的影響不大，并且停止灌胃后便可以恢復(fù)正常。

雌性大鼠生殖功能的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)主要通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸來(lái)調(diào)控，即下丘腦通過(guò)分泌促性腺激素釋放激素來(lái)調(diào)節(jié)垂體促性腺激素的分泌，促性腺激素再通過(guò)外周血液循環(huán)作用于性腺，進(jìn)一步促進(jìn)性腺分泌性激素，性激素和性器官上的受體結(jié)合來(lái)調(diào)控雌性動(dòng)物的發(fā)育。大鼠灌胃蜂王漿4 周后，E2水平顯著高于對(duì)照組，停止灌胃2 周后大鼠體內(nèi)主要性激素水平恢復(fù)正常，表明蜂王漿可以提高大鼠體內(nèi)雌二醇水平，停止蜂王漿刺激后雌二醇水平恢復(fù)正常，這一發(fā)現(xiàn)可為治療女性體內(nèi)雌激素水平偏低提供參考。

激素活性是通過(guò)受體介導(dǎo)的，但是激素受體功能的發(fā)揮受多種因素調(diào)節(jié)，包括協(xié)同調(diào)節(jié)因子、蛋白翻譯后修飾，受體基因轉(zhuǎn)錄水平等。本研究中灌胃蜂王漿提高子宮和卵巢中FSHR和PR mRNA表達(dá)量，但是血清中FSH和P水平并沒(méi)有顯著變化，這可能是蜂王漿中的活性物質(zhì)直接抑制了調(diào)節(jié)因子的活性或者蛋白翻譯后的修飾過(guò)程，具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究［18］。雌激素的生理作用主要由ERα和ERβ兩種受體亞型介導(dǎo)。雌激素兩種受體的表達(dá)具有組織和細(xì)胞特異性，雌二醇在此過(guò)程對(duì)兩種受體有不同的調(diào)節(jié)作用［24］。本實(shí)驗(yàn)中灌胃高劑量的蜂王漿大鼠卵巢中ERα以及子宮中ERα和ERβ mRNA表達(dá)量顯著增加，一方面可能是由于血清雌二醇水平增加加強(qiáng)了雌激素受體的活化，另一方面也可能是蜂王漿中的活性物質(zhì)直接作用于不依賴于雌激素受體活化的磷酸化過(guò)程，有研究表明存在一些信號(hào)通路可以不通過(guò)激素而激活雌激素受體［25］，具體引起本實(shí)驗(yàn)中雌激素受體表達(dá)量顯著增加的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。停止灌胃2 周后卵巢和子宮中主要性激素受體的表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組，這可能與蜂王漿發(fā)揮作用的延遲有關(guān)，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

雌激素是維持女性生理最重要的激素，廣泛參與體內(nèi)物質(zhì)及能量的代謝。雌性進(jìn)入青春期后由卵巢分泌進(jìn)入血液與性激素結(jié)合蛋白和白蛋白可逆性結(jié)合，擴(kuò)散到靶組織發(fā)揮生理作用［26］。實(shí)驗(yàn)中高劑量的蜂王漿活化了雌激素受體基因的表達(dá)，促進(jìn)血清中雌激素含量的增加。血清雌激素含量增加可能是大鼠體質(zhì)量減輕的主要因素，這與前人的研究雌激素與動(dòng)物肥胖有關(guān)是一致的［27-28］。同時(shí)，前人的研究結(jié)果表明雌激素及其受體的過(guò)表達(dá)與乳腺癌、子宮內(nèi)膜炎和卵巢癌的發(fā)生有關(guān)［29-31］，而本研究中血清中E2含量的增加以及雌激素受體和孕激素受體表達(dá)量增加可能是實(shí)踐中蜂王漿引起部分女性發(fā)生子宮等性器官病變的原因。雖然蜂王漿中雌激素是痕量的，但是年輕女性本身體內(nèi)雌激素分泌較旺盛，因此建議年輕女性慎重食用。

目前，關(guān)于低劑量蜂王漿對(duì)動(dòng)物有益作用的研究較多［17-19］，但關(guān)于高劑量蜂王漿對(duì)雌性哺乳動(dòng)物的研究較少。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)高劑量蜂王漿對(duì)雌性大鼠生長(zhǎng)發(fā)育影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明，持續(xù)灌胃高劑量的蜂王漿會(huì)抑制大鼠體質(zhì)量的增加，對(duì)大鼠臟器系數(shù)沒(méi)有影響，促使大鼠血清中E2的水平上升；停止灌胃2 周后，卵巢和子宮中ERβ、FSHR、PR以及子宮中ERα mRNA的表達(dá)量顯著升高。這些作用結(jié)果的具體機(jī)制以及是由蜂王漿中的哪種特定物質(zhì)引起的還不清楚，后續(xù)的研究將深入探討蜂王漿中特定物質(zhì)對(duì)大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的具體機(jī)制，為更合理有效地利用蜂王漿提供理論依據(jù)。

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Effect of Royal Jelly on Growth and Development of Female Rats

SHEN Fang， LIU Zhenguo， SHEN Jie， JI Ting*
（College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

Objective： To investigate the effect of high dose of royal jelly on the growth and development of female rats. Methods： The rats were given by gavage fresh royal jelly in the experimental group at a dose of 3 g/（200 g·d） body weight（BW）， while the rats in the control group was administered by gavage with normal saline at a dose of 3 mL/（200 g·d）BW. After 4 weeks of administration， the rats were continuously fed for additional 2 weeks. Eight rats from each group were anatomized every two weeks. The visceral indexes of heart， liver， spleen， lung， kidney and adrenal grand were examined. Serum estradiol （estradiol， E2）， follicle stimulating hormone （FSH）， luteinizing hormone （LH） and progesterone（progesterone， P） was detected with radioimmunoassay. Real-time PCR was used to detect the expression levels of estrogen receptor alpha （ERα）， estrogen receptor beta （ERβ）， follicle stimulating hormone receptor （FSHR）， luteinizing hormone receptor （LHR） and progesterone receptor （PR）. The results showed that there was no signifi cant difference between the experiment and control groups after 2 weeks of administration， but a signifi cant difference was found after 4 weeks. Body weight in the experiment group was signifi cantly lower than in the control group， E2 level was signifi cantly higher than in the control group， and the mRNA expression level of ovarian PR was higher than in the control group. The expression levels of ERα， ERβ and PR in uterus were signifi cantly higher than in the control group. At 2 weeks after administration， there was no signifi cant difference in body weight， organ coeffi cients or serum sex hormone levels between both groups. But the mRNA expression level of FSHR， ERβ and PR in the ovary were signifi cantly higher than those in the control group， and the expression levels of ERα， ERβ， FSHR and PR in the uterus were signifi cantly higher than those in the control group. In all， the growth and development of female rats were infl uenced by the gavage administration of high-dose royal jelly to some extent.

royal jelly； organ coeffi cient； hormone； hormone receptor

S896.3

A

1002-6630（2015）03-0202-05

10.7506/spkx1002-6630-201503039

2014-05-17

揚(yáng)州大學(xué)服務(wù)蜂業(yè)專業(yè)合作社科技服務(wù)專項(xiàng)（SBE201230535）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（蜂）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-45-SYZ6）

沈芳（1990—），女，碩士研究生，主要從事蜜蜂遺傳學(xué)研究。E-mail：shenshuanger@126.com

吉挺（1974—），男，副教授，博士，主要從事蜜蜂種質(zhì)資源保護(hù)和利用研究。E-mail：tji@yzu.edu.cn