顧偉，羅旋，匡勇△

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，上海 200001)

1 引 言

由于創(chuàng)傷、手術(shù)切除、先天畸形等原因?qū)е碌能浗M織缺損，采用組織移植以改善或恢復(fù)生理功能或外形是最重要的治療手段。自體脂肪組織其生物相容性好，質(zhì)地、外形自然而不存在免疫排斥反應(yīng)，是軟組織缺損修復(fù)的最理想材料。但脂肪移植術(shù)后往往在長(zhǎng)期觀察中出現(xiàn)脂肪細(xì)胞成活率低，移植物組織被吸收等問(wèn)題。2007年Yoshimura[1]等報(bào)導(dǎo)了將脂肪干細(xì)胞與脂肪共同移植進(jìn)行軟組織填充，有效提高了成活率，并將這一技術(shù)命名為細(xì)胞輔助的脂肪移植(cell assisted lipotransfer, CAL)。其不足之處是，需要消耗更多的脂肪組織，以獲得脂肪組織中的各種細(xì)胞(主要是脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，血管內(nèi)皮前體細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等)。而需要脂肪移植的患者，常不能提供足夠的優(yōu)質(zhì)脂肪量。另外，脂肪細(xì)胞作為成體細(xì)胞隨著患者年齡的增加其增殖分化能力不斷下降[2]。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)應(yīng)用來(lái)源更加廣泛，且無(wú)創(chuàng)的臍帶間充質(zhì)細(xì)胞來(lái)替代脂肪間充質(zhì)細(xì)胞，對(duì)比研究脂肪干細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在輔助游離脂肪移植中的異同。

2 實(shí)驗(yàn)材料及方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所涉及的臍帶均來(lái)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，由無(wú)任何基礎(chǔ)疾病產(chǎn)婦提供，4名，25～34歲；脂肪組織來(lái)自上海交通大學(xué)仁濟(jì)醫(yī)院整形外科，由無(wú)任何基礎(chǔ)疾病吸脂求美者提供，6名，27～43歲。所有提供者均知情同意。

本實(shí)驗(yàn)所用裸鼠均來(lái)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，4周齡，雌性。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

我們?cè)O(shè)計(jì)應(yīng)用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與脂肪組織顆?；旌虾?，移植到裸鼠皮下，與單純脂肪組織移植作對(duì)照，不同的時(shí)間觀察其在改善組織缺損和轉(zhuǎn)歸及作用機(jī)制的異同。

取傳至第3代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(1x106)制成80 ul稀薄懸液，與脂肪顆粒(0.5ml)混合為實(shí)驗(yàn)組，80 ul培養(yǎng)液與脂肪顆粒(0.5 ml)混合為對(duì)照組，在相同條件下移植于裸鼠皮下，經(jīng)一周，一個(gè)月，兩個(gè)月時(shí)間，取出移植物，觀察大體吸收情況，測(cè)量移植物重量，血管生成情況，real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGF、PPAR-γ基因表達(dá)情況。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0對(duì)其進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

移植第一周后，兩組間移植物的大小和重量沒(méi)有明顯改變。1個(gè)月時(shí)，兩組移植物較1周時(shí)縮小，提示有部分被吸收，2個(gè)月時(shí)，兩組移植物均明顯被吸收(見(jiàn)圖1A)。三個(gè)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)重量的差異沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1B)。

表1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞輔助游離脂肪移植各組移植物重量(單位：g)

圖1 移植物的大體觀及重量

可見(jiàn)1周時(shí)兩組移植物未見(jiàn)明顯吸收，大體及重量相近；一個(gè)月時(shí)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組移植物重量略高，2個(gè)月時(shí)，對(duì)照組幾乎全部吸收，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組也有大部分被吸收，僅有少量存留。

Fig1Grossappearanceoftransplantatedtissues

There is no obvious change both in control and UCMSCs groups at 1week after transplantation. At 1month and 2months post-transplantation, UCMSCs supplemented grafts are a bit bigger than control group,and the weight are a little higher.

各組移植物取下后立即固定、包埋、切片、HE染色，觀察組織內(nèi)細(xì)胞成活及血管生成情況。見(jiàn)圖2。

3.2 Real-time PCR分析

移植物中的VEGF、PPAR-γ基因表達(dá)水平通過(guò)real-time PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 移植物組織切片的HE染色兩組移植物脂肪組織改變差異不明顯。物鏡10倍放大。

圖3 移植物中PPAR-γ、VEGF基因表達(dá)水平

三個(gè)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)中，兩組間PPAR-γ表達(dá)相同，而臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組VEGF表達(dá)較高。

Fig3Real-timePCRanalysisofthePPAR-γ，VEGFgeneexpression

The UCMSCs group have higher VEGF gene expression, while no difference between the two groups about PPAR-γexpression

各組移植物中的PPAR-γ基因表達(dá)顯示，移植后1周，對(duì)照組與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ的表達(dá)基本相同，移植后1個(gè)月、2個(gè)月兩組PPAR-γ基因表達(dá)也未見(jiàn)顯著改變，兩組間PPAR-γ基因表達(dá)水平之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3A)。移植后1周，對(duì)照組與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組VEGF基因表達(dá)水平均較低，無(wú)顯著差異；在1個(gè)月和2個(gè)月時(shí)，兩組VEGF表達(dá)維持在較低水平，無(wú)顯著的改變，對(duì)照組與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3B)。

4 討論

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是一種原始的間充質(zhì)干細(xì)胞，可以在體外條件下穩(wěn)定傳代和凍存復(fù)蘇，而不發(fā)生自發(fā)分化，且可以保持較強(qiáng)的增殖能力[3]。體外經(jīng)化學(xué)試劑和生長(zhǎng)因子作用后，可以分化為軟骨、骨和脂肪等中胚層來(lái)源的細(xì)胞，而且可以轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等外胚層來(lái)源的細(xì)胞[4-5]。大部分成體干細(xì)胞的增殖分化活力會(huì)隨著年齡增長(zhǎng)而衰退[6]，但臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不存在上述問(wèn)題，而仍然能夠保持較強(qiáng)的增殖分化能力[7]。同時(shí)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分泌抑制細(xì)胞凋亡的生長(zhǎng)因子，具有免疫豁免和免疫調(diào)節(jié)的特性，無(wú)同種異體免疫排斥反應(yīng)，且儲(chǔ)量豐富，獲取方便，體外培養(yǎng)擴(kuò)增穩(wěn)定，是臨床應(yīng)用中一種較為理想的干細(xì)胞[8]。

本實(shí)驗(yàn)以單純的脂肪移植作為對(duì)照，將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪混合后作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在移植后第一周，兩組移植物均未表現(xiàn)出明顯的吸收；1個(gè)月，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組的移植物略高于單純脂肪對(duì)照組；2個(gè)月的長(zhǎng)期觀察中，兩組移植物均有較大程度的吸收，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組移植物重量仍略高于對(duì)照組，然而所有觀察時(shí)間點(diǎn)兩組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步將兩組移植物內(nèi)血管生長(zhǎng)因子VEGF和成脂轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ的基因表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞并不能顯著提高移植物中VEGF及PPAR-γ的表達(dá)，雖然文獻(xiàn)[5]提到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、干細(xì)胞因子等，然而，我們的研究結(jié)果表明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于特定的細(xì)胞因子VEGF及轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ基因表達(dá)沒(méi)有促進(jìn)作用，提示臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不能像脂肪干細(xì)胞一樣促進(jìn)移植物的血管新生和成脂分化。

移植物中脂肪細(xì)胞成活的數(shù)量和單個(gè)細(xì)胞的脂肪含量決定著移植物的體積。其內(nèi)部所含的干細(xì)胞成脂分化能力也會(huì)對(duì)移植物的體積產(chǎn)生影響。有研究證實(shí)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在成脂分化方面的速度要慢于脂肪干細(xì)胞，在同等誘導(dǎo)條件下，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞需要較長(zhǎng)時(shí)間才能夠出現(xiàn)脂肪細(xì)胞的形態(tài)改變以及完成向成脂細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過(guò)程[9]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因有可能是由于干細(xì)胞本身的組織特異性所致：來(lái)源于某一組織的干細(xì)胞會(huì)一定程度的保留原有組織的特性，某些決定其向原組織細(xì)胞分化的基因在誘導(dǎo)之前就已經(jīng)處于預(yù)激活狀態(tài)。脂肪干細(xì)胞是脂肪組織內(nèi)具備增殖和分化能力的干細(xì)胞，承擔(dān)著脂肪組織內(nèi)成熟脂肪細(xì)胞更新的來(lái)源，能夠高效的分化為成熟脂肪細(xì)胞，本就有較高的成脂分化傾向，其基因組中成脂分化轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ表達(dá)較其他組織來(lái)源干細(xì)胞處于較高水平。本實(shí)驗(yàn)中的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞并不能夠促進(jìn)移植物中PPAR-γ基因表達(dá)的明顯增高，而來(lái)源于脂肪組織的脂肪干細(xì)胞則能夠很好的提高移植物中相關(guān)成脂基因PPAR-γ的表達(dá)，說(shuō)明在干細(xì)胞輔助脂肪移植中，其組織來(lái)源影響了這些細(xì)胞在移植后作用的發(fā)揮。這可能是導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)結(jié)果移植物重量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的原因之一。

綜上，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不能夠有效提高移植物重量、成脂以及血管生成的修復(fù)效應(yīng)，其作為脂肪干細(xì)胞的替代，用于游離脂肪移植的效果尚不成熟。