范春光，孫立魁，劉增祥，劉成虎，李春令，侯麗

(山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心; 山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評價重點實驗室，山東 濟南 250101)

1 引 言

熱原檢測是醫(yī)療器械生物學(xué)評價中的重要項目。目前，醫(yī)療器械熱原檢測試驗有兩種：細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法(鱟試劑法)和兔法。2009年，歐洲藥典收錄了體外熱原檢查法，美國FDA也接受了5種基于人免疫細(xì)胞的注射用藥熱原體外試驗法[1]。研究[2]表明，人全血IL-1β ELISA試驗是較為理想的體外檢測法。但是，此方法并未在醫(yī)療器械領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。本實驗中，我們驗證了人全血IL-1β試驗應(yīng)用于醫(yī)療器械熱原檢測的可行性，并對該法中人全血與樣品直接孵育(直接接觸法)測得的內(nèi)毒素當(dāng)量和人全血與樣品浸提液孵育(浸提液法)測得量進(jìn)行了比較與分析。此方法有很好的應(yīng)用前景，某一試驗樣品在經(jīng)過特異性確認(rèn)后，可以應(yīng)用此方法作為以上兩種方法的替代方法。

2 試驗材料及儀器

2.1 試驗材料

人抗凝新鮮全血(至少4人混合)，無菌無熱原生理鹽水(山東華魯制藥有限公司，批號：1311182161)，人IL-1β ELISA試劑盒(ExCell，批號：ZJBIBZAD03)，脂多糖O113(LPS O113)(LIST BIOLOGICAL，批號：4331B1)，脂磷壁酸(LTA)(SIGMA，批號：044M4000V)，一次性使用無菌無熱原輸液器為市售商品。

2.2 儀器

采血管(BD，K2EDTA，批號：4034487)，采血針(BD，0.6×20mm×180mm，批號：1349187)，無菌無熱原1.5mL反應(yīng)管(AXYGEN，批號：311-08-081)，15mL反應(yīng)管(AXYGEN，批號：100525-02904)，微量移液器(eppendorf，1μL-5mL)，無菌無熱原槍頭(200μL，KG1232，批號：130714；1mL，KG1232，批號：130105)，離心機(SIGMA，型號：1-14K)，37°C培養(yǎng)箱(memmert，型號：ICP700)，250°C烘箱(BINDER，型號：FED240)，酶標(biāo)儀(Thermo，型號：Multiscan MK3)。

3 試驗方法

3.1 樣品制備

在潔凈室潔凈工作臺內(nèi)用經(jīng)除熱原處理的手術(shù)剪、鑷子(250℃，30 min)剪取無菌無熱原輸液器滴斗部分，裁剪至0.5 cm×0.5 cm大小數(shù)十片備用。用無菌無熱原生理鹽水溶解LPS O113稀釋至2 ng/mL，用微量移液器吸取10 μL溶液小心置于輸液器滴斗小片上，潔凈工作臺內(nèi)過夜晾干，制備LPS O113陽性樣品A。用無菌無熱原生理鹽水溶解LTA稀釋至2 mg/mL，用微量移液器吸取10 μL溶液小心置于輸液器滴斗小片上，過夜晾干，制備LTA陽性樣品B。孵育前1 h，按照細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法要求制備樣品浸提液。取陽性樣品A10片加入1 ml生理鹽水，置于37℃孵育1 h后，震蕩得到樣品浸提液C，同法制備樣品B浸提液D。

3.2 加樣孵育

3.2.1分別將100 μL濃度為0、25、50、100、200、400、800 pg/mL的LPS O113(溶于生理鹽水)加入盛有1 ml生理鹽水的1.5 ml反應(yīng)管中，標(biāo)記為R0、R1、R2、R3 、R4、R5、R6，每種濃度平行制備3管，用于制作濃度反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2.2取1.5 ml反應(yīng)管，加入1.1 ml生理鹽水，再分別加入樣品A、B，各平行制備3管。取1.5 ml反應(yīng)管，加入1 ml生理鹽水，分別加入樣品A、B，再加入100 μL R3(100 pg/mL)，用于計算內(nèi)毒素回收率，各平行制備3管標(biāo)記為A+、B+。取1.5 ml EP管加入1 ml生理鹽水，再分別加入100 μL浸提液C、D，各平行制備3管。另取EP管，加入900 uL生理鹽水，后分別加入100 μL浸提液C、D，再加入100 μL R3(100 pg/mL)，用于計算內(nèi)毒素回收率，各平行制備3管標(biāo)記為C+、D+。在加入血液之前，混合物要在無菌操作臺放置至少1 h。

3.2.3選取4名健康志愿者(24-29歲，兩周內(nèi)未服藥)采用無菌、無熱原抗凝采血管靜脈采血，采血后經(jīng)白細(xì)胞分類計數(shù)排除感染，等體積混合，4 h內(nèi)使用。將100 μL混勻的抗凝鮮血加入到每一個反應(yīng)管內(nèi)，使總體積為1 200 μL，蓋上各反應(yīng)管，輕輕混勻。

3.2.4將反應(yīng)管靜置于37℃，5%CO2潮濕培養(yǎng)箱內(nèi)過夜(14-24 h)，13 000 g離心2 min，取上清。

3.3 檢測

按人IL-1β ELISA試劑盒說明書操作，測定各反應(yīng)管上清IL-1β的含量。

3.4 計算

3.4.1根據(jù)試劑盒中IL-1β標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度與相應(yīng)的吸光度值(OD值)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)得到的回歸方程計算各反應(yīng)管內(nèi)IL-1β的含量。

3.4.2根據(jù)不同濃度梯度的內(nèi)毒素O113的量與相應(yīng)的IL-1β的含量建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算回歸方程。

3.4.3計算試驗溶液的內(nèi)毒素當(dāng)量及其內(nèi)毒素回收率。當(dāng)回收率在50%～200%之間，則認(rèn)為在此試驗條件下，試驗溶液不干擾試驗系統(tǒng)。

3.4.4對直接接觸法測得的內(nèi)毒素當(dāng)量和浸提液法測得量進(jìn)行比較與分析。

4 結(jié)果

4.1根據(jù)試劑盒中IL-1β標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度(y)與相應(yīng)的吸光度值(OD值)(x)建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線1(見圖1)。線性回歸方程為：y=400.84x-48.18，R2=0.999。

4.2根據(jù)以上回歸方程計算得到各反應(yīng)管內(nèi)IL-1β的含量，根據(jù)不同濃度梯度的內(nèi)毒素O113的量(x)與相應(yīng)的IL-1β的含量(y)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)，并得到回歸方程：y=226.45Ln(x)-1020.40，R2=0.96。

圖1 IL-1β檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 IL-1β回歸方程曲線

4.3根據(jù)曲線回歸方程得到了試驗溶液的內(nèi)毒素當(dāng)量平均值及回收率見表1。

表1 各試驗溶液內(nèi)毒素當(dāng)量及回收率

4.4樣品A、B直接接觸法與浸提液法的測得結(jié)果對比見表2。

表2直接接觸法與浸提液法的測得結(jié)果對比

Table2Comparisonoftheresultsbetweendirectcontactmethodandextractmethod

樣品直接接觸法結(jié)果均值(pg/mL)浸提液法結(jié)果均值(pg/mL)內(nèi)毒素(LPS) O113252.3191.4脂磷壁酸(LTA)113.4119.7

圖3直接接觸法與浸提液法的測得結(jié)果對比

Fig3Comparisonoftheresultsbetweendirectcontactmethodandextractmethod

5 討論

人全血IL-1β ELISA法是單核細(xì)胞激活試驗(MAT)的一種。熱原物質(zhì)進(jìn)入人體后，會激活單核細(xì)胞使其釋放IL-1β、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子。MAT對以上細(xì)胞因子進(jìn)行定量檢測以間接反映熱原物質(zhì)的量。其中，IL-1β的檢測具有較高的信噪比，是較好的細(xì)胞因子熱原標(biāo)志物。所以，人全血IL-1β ELISA法是單核細(xì)胞激活試驗中最為理想的熱原體外檢測法。

在本實驗中，我們制備了內(nèi)毒素陽性樣品和非內(nèi)毒素陽性樣品以及其浸提液。實驗結(jié)果證明，以上樣品均能采用人全血IL-1β ELISA法進(jìn)行檢測。在實際應(yīng)用過程中，對于一些小型醫(yī)療器械如血管支架、角膜接觸鏡等可以采用直接接觸法；對于不易直接接觸的樣品，可按照內(nèi)毒素檢查法制備樣品浸提液后，采用此法進(jìn)行檢測。

本研究表明，在本實驗系統(tǒng)內(nèi)，100 pg/mL內(nèi)毒素當(dāng)量濃度的溶液即可穩(wěn)定刺激人全血釋放出可以檢測到的IL-1β，在采用內(nèi)毒素檢查法中的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品替代LPSO113作為本法標(biāo)準(zhǔn)品的試驗中，0.125 EU/mL的濃度即可被檢測出。此試驗的靈敏度完全能夠滿足檢測要求。

本實驗中，內(nèi)毒素O113陽性樣品組，人全血IL-1β法直接接觸法測得的內(nèi)毒素當(dāng)量高于樣品浸提液中的測得量；脂磷壁酸(LTA)陽性樣品組，直接接觸法測得值與浸提液測得值量相當(dāng)。出現(xiàn)以上結(jié)果的原因可能是因為兩種物質(zhì)的溶解度不同導(dǎo)致的，按現(xiàn)有的浸提方法可能無法保證樣品上的內(nèi)毒素被完全浸提下來，而脂磷壁酸較易于浸提。研究表明，按照現(xiàn)有的浸提方法無法保證醫(yī)療器械中致熱原，特別是其表面粘附的細(xì)菌碎片等殘留物被有效浸提出來[3]，而且有研究發(fā)現(xiàn)，移植物表面粘附的細(xì)菌碎片釋放的內(nèi)毒素是導(dǎo)致移植失敗的重要原因[4]。人全血IL-1βELISA試驗可以通過直接接觸法進(jìn)行更為有效地檢測，而這一優(yōu)勢是傳統(tǒng)方法所不具備的。

本試驗證明，非內(nèi)毒素類致熱原如LTA也可使用本方法檢測。本方法檢測譜較寬，能夠刺激人體產(chǎn)生IL-1β的熱原物質(zhì)，理論上均可通過本法檢測出。另外，本法采用人全血檢測，消除了種屬差異的問題，而且也契合了“3R”原則，有利于動物福利的保護(hù)，也符合體外試驗替代動物試驗的大趨勢。

相信經(jīng)過后續(xù)工作的不斷完善，熱原體外檢測法——人全血IL-1β法能夠應(yīng)用于醫(yī)療器械生物學(xué)安全評價系統(tǒng)中，為醫(yī)療器械的使用提供更為安全有效的保障。