陶宏征等

摘要：為篩選適合工業(yè)發(fā)酵的抗枇杷根腐病病菌中的枇杷主干內(nèi)生真菌菌株，對抗枇杷根腐病病菌的6株枇杷主干內(nèi)生真菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明：在參試菌株中，DPZG15菌株生長適應(yīng)性最強，對pH值、光無特殊要求，在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基、麥芽糖或蔗糖為碳源、牛肉膏或酵母膏為氮源、25～28 ℃條件下生長達(dá)到最佳水平。

關(guān)鍵詞：枇杷；內(nèi)生真菌；枇杷根腐??；生物學(xué)特性

中圖分類號： S436.67+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0166-03

枇杷（Eriobotrya japonica）為薔薇科常綠喬木果樹，是我國亞熱帶地區(qū)的特色水果[1]，含川貝堿、西貝素等多種生物堿[2]。植物內(nèi)生真菌普遍存在于各種植物健康組織內(nèi)或細(xì)胞間隙，不僅能促進(jìn)寄主植物生長，還可以產(chǎn)生與寄主相同或相似的次級代謝產(chǎn)物，具有抗菌、殺蟲等多種生物活性[3-6]。目前，尚未見枇杷內(nèi)生真菌的研究報道。枇杷根腐病是枇杷生產(chǎn)上發(fā)生嚴(yán)重而普遍的土傳病害之一，其田間癥狀初期表現(xiàn)出樹勢衰退，葉片起初變黃，之后變成褐色；葉子在脫落之前緩慢下垂；偶爾下大雨時，植株發(fā)病較快，只留下褐色干枯的葉片掛在死樹枝上；莖干顏色呈暗褐色，基部腐爛，韌皮部呈魚鱗狀；地上部維管組織呈紅褐色；后期植株萎蔫、樹皮脫落，最后整株枯死。臺灣[7]、福建[8]、云南[9]等省份陸續(xù)報道有枇杷根腐病發(fā)生，損失率高達(dá)40%以上，且有逐漸加重之勢，制約著枇杷產(chǎn)業(yè)發(fā)展?；瘜W(xué)防治對于土傳病害收效甚微，加上化學(xué)農(nóng)藥不符合綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)要求，生物防治日趨受到人們的重視。鑒于此，本研究從枇杷主干內(nèi)生真菌中挑選對枇杷根腐病病菌抑制率高于50%的菌株[10]，對其進(jìn)行生物學(xué)特性研究，為其工業(yè)發(fā)酵提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1枇杷主干內(nèi)生真菌從蒙自枇杷園區(qū)采集枇杷主干韌皮部，常規(guī)組織分離[11]獲得6株參試菌株，其中菌株DPZG11、DPZG12、DPZG13、DPZG14、DPZG15、DPZG16 均為枝頂孢屬（Acremonium）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：200 g 馬鈴薯、16 g葡萄糖、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）：200 g馬鈴薯、16 g蔗糖、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（CA）：200 g胡蘿卜、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；玉米瓊脂培養(yǎng)基（MA）：30 g 玉米、17 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；小麥瓊脂培養(yǎng)基（WA）：30 g小麥、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；枇杷瓊脂培養(yǎng)基（LA）：200 g枇杷葉、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；察氏 培養(yǎng)基：2.00 g硝酸鈉、1.00 g磷酸二氫鉀、0.50 g氯化鉀、0.50 g七水硫酸鎂、0.01 g硫酸鐵、30.00 g蔗糖、20.00 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水。所用試劑均為分析純。

1.1.3試劑碳源為可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、α-乳糖、葡萄糖、甘露醇；氮源為酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨；均為分析純。

1.2試驗方法

1.2.1測定不同培養(yǎng)基對參試菌株菌絲生長的影響將枇杷主干內(nèi)生真菌在PDA平板培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫擴(kuò)大培養(yǎng) 7 d[11]，在培養(yǎng)基同一半徑周圍用打孔器取直徑為5 mm的菌餅，同時接種于PDA、PSA、CA、MA、WA、LA 6種培養(yǎng)基平板中央，設(shè)3次重復(fù)，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法[11]測定各菌株菌落直徑。

1.2.2測定碳、氮源對參試菌株菌絲生長的影響以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用相等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳源（可溶性淀粉、麥芽糖、α-乳糖、葡萄糖、甘露醇）和氮源（酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨）替換蔗糖和硝酸鈉，接種及測量方法同“1.2.1”節(jié)相關(guān)步驟[11]。

1.2.3測定不同pH值對參試菌株菌絲生長的影響以PDA為供試培養(yǎng)基，用0.1%鹽酸、0.1%氫氧化鈉將pH值調(diào)至4、5、6、7、8、9、10，接種及測量方法同“1.2.1”節(jié)相關(guān)步驟[11]。

1.2.4測定不同溫度對參試菌株菌絲生長的影響以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在5、10、15、20、25、30、35、40 ℃下恒溫培養(yǎng)，接種及測量方法同“1.2.1”節(jié)相關(guān)步驟[11]。

1.2.5測定不同光處理對參試菌株菌絲生長的影響以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在光暗交替（12 h光照、12 h黑暗）、全黑暗、全光照3種光處理下培養(yǎng)，接種及測量方法同“1.2.1”節(jié)相關(guān)步驟[11]。

以上所有培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌25 min。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件的Duncans多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算處理間的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)基對參試菌株菌絲生長的影響

表1顯示，參試菌株DPZG11在PDA、PSA 2種培養(yǎng)基間菌落直徑差異不顯著，在WA、LA 2種培養(yǎng)基間差異顯著，在其余2種供試培養(yǎng)基差異極顯著；DPZG12、DPZG13在CA、MA 2種培養(yǎng)基間菌落直徑差異不顯著，但與其余4種供試培養(yǎng)基差異極顯著；DPZG14在PSA、MA 2種培養(yǎng)基間菌落直徑差異不顯著；DPZG15在供試的6種培養(yǎng)基間菌落直徑差異極顯著；DPZG16在PSA、CA 2種培養(yǎng)基間菌落直徑差異不顯著，在WA、LA 2種培養(yǎng)基間差異也不顯著，但與其余2種供試培養(yǎng)基差異極顯著。其中，菌株DPZG14、DPZG16 菌絲生長最適合的培養(yǎng)基為PDA，菌株DPZG12、DPZG13菌絲生長最適合的培養(yǎng)基為PSA，DPZG15菌絲生長最適合的培養(yǎng)基為CA，DPZG11菌絲生長最適合的培養(yǎng)基為PDA或PSA。結(jié)果說明，參試菌株營養(yǎng)適應(yīng)性存在多樣性。

2.2不同碳源對參試菌株菌絲生長的影響

由表2顯示，參試菌株DPZG11在供試的6種碳源間菌落直徑差異極顯著；DPZG12在葡萄糖、蔗糖2種碳源間菌落直徑差異不顯著，在可溶性淀粉、甘露醇2種碳源間菌落直徑差異也不顯著，但與α-乳糖差異極顯著；DPZG13在葡萄糖、α-乳糖2種碳源間菌落直徑差異不顯著，但與其余3種供試碳源差異極顯著；DPZG14在麥芽糖、甘露醇2種碳源中菌落直徑差異不顯著，在葡萄糖、α-乳糖 2種碳源間菌落直徑差異也不顯著，但與可溶性淀粉差異極顯著；DPZG15在葡萄糖、可溶性淀粉2種碳源間菌落直徑差異不顯著，在蔗糖、麥芽糖2種碳源間菌落直徑差異也不顯著，但與其余2種供試碳源差異極顯著；DPZG16在葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉3種碳源中菌落直徑差異不顯著，所有碳源均與α-乳糖差異極顯著。其中，DPZG11、DPZG13菌株菌絲生長最適合的碳源為麥芽糖，DPZG14最適合的碳源為可溶性淀粉，DPZG15最適合的碳源為蔗糖或麥芽糖，DPZG16最適合的碳源為蔗糖或甘露醇，DPZG12在不添加碳源的培養(yǎng)基中菌落直徑最大，對碳源無依賴性，結(jié)果表明，參試菌株碳源適應(yīng)性同樣存在多樣性。

2.3不同氮源對參試菌株菌絲生長的影響

由表3顯示，參試菌株DPZG11在硫酸銨、尿素2種氮源

2.5不同溫度對參試菌株菌絲生長的影響

由表5顯示，參試菌株在10～35 ℃范圍內(nèi)均能生長。DPZG11菌株菌絲生長最適合的溫度為25～30 ℃；DPZG12最適合的溫度為25 ℃；DPZG13、DPZG14最適合的溫度為30 ℃；DPZG15最適合的溫度為25～28 ℃；DPZG16最適合的溫度為20 ℃。說明各參試菌株的溫度適應(yīng)性也存在差異。

2.6不同光處理對參試菌株菌絲生長的影響

由表6顯示，在光暗交替（12 h光照、12 h黑暗）、全黑暗、全光照3種光處理下，DPZG11、DPZG12、DPZG15菌株菌落直徑均達(dá)90.0 mm，生長不受光的影響；DPZG13、DPZG14在全光照時菌落直徑最大；DPZG16菌株全黑暗最適合其菌絲生長。說明參試菌株對光的適應(yīng)性也存在差異。

3結(jié)論與討論

在6種供試培養(yǎng)基中，PDA、PSA、CA培養(yǎng)基最適合各參試菌株菌絲生長，此研究結(jié)果與筆者所在課題組報道的另外6株枇杷內(nèi)生真菌的研究結(jié)果[12]一致。在供試碳源中，麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇最適合各參試菌株菌絲生長，此結(jié)果與筆者所在課題組報道的另外6株枇杷內(nèi)生真菌的研究結(jié)果[12]不一致。在供試氮源中，牛肉膏、酵母膏、蛋白胨最適合各參試菌株菌絲生長，此結(jié)果與筆者所在課題組報道的其余6株枇杷內(nèi)生真菌[12]、銀杏內(nèi)生真菌[13]的研究結(jié)果一致。20～30 ℃最適合各參試菌株菌絲生長，此結(jié)果與鹿蹄草屬內(nèi)生真菌的研究結(jié)果[14]不一致。DPZG12、DPZG15生長不受pH值及光照限制，其他4個菌株最適合的pH值及光照各不相同，此研究結(jié)果與筆者所在課題組報道的另外6株枇杷內(nèi)生真菌的研究結(jié)果[12]不一致。試驗結(jié)果表明，枇杷主干中的各內(nèi)生真菌菌株生長喜好不盡相同，其中DPZG15菌株生長適應(yīng)性最強，較其他菌株更具開發(fā)應(yīng)用優(yōu)勢。

各參試菌株均為枝頂孢屬真菌，葉利芹等曾研究赭紅枝頂孢（Acremonium salmoneum）培養(yǎng)條件[15]及其竹葉銹病菌的重寄生作用[16]。枝頂孢屬作為殺蟲生防制劑的研究也有報道[17-18]。另外，黎起秦等用針刺接種法和浸根法將內(nèi)生菌B47成功地定殖到番茄體內(nèi)[19]。江木蘭等通過浸種法把油菜內(nèi)生生防菌BY-2定殖到油菜體內(nèi)[20]。李紅剛等又通過研磨組織涂抹法把內(nèi)生放線菌定殖植株體內(nèi)[21]。而定殖的生防菌株受到植物組織的良好保護(hù)[22]，這為今后DPZG15定殖到植株體內(nèi)提供了理論支持和經(jīng)驗借鑒。

參考文獻(xiàn)：

[1]江國良. 枇杷在四川不同生態(tài)型區(qū)的生態(tài)適宜性及調(diào)控技術(shù)研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011：1-152.

[2]何志剛，林曉姿，李維新，等. 枇杷的營養(yǎng)保健與川貝枇杷低糖果醬的研制[J]. 食品科學(xué)，2005，26（9）：258-260.

[3]文才藝，吳元華，田秀玲. 植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及其存在的問題[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2004，23（2）：86-91.

[4]黎萬奎，胡之璧. 內(nèi)生菌與天然藥物[J]. 中國天然藥物，2005，3（4）：193-199.

[5]郭良棟. 內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J]. 菌物系統(tǒng)，2001，20（1）：148-152.

[6]王維，馬養(yǎng)民，張弘弛，等. 黑果枸杞內(nèi)生真菌E21菌株次生代謝產(chǎn)物的研究[J]. 中國新藥雜志，2013，22（4）：460-464.

[7]Chern L L，Ann P J， Young H R. Root and foot rot of loquat in Taiwan caused by Phytophthora[J]. Plant Dis. 1998，82：651-656.

[8]莊文遠(yuǎn)，吳志珍，曾忠堅.枇杷根腐病的發(fā)生與防治技術(shù)[J]. 廣西植保，2002，15（1）：8-9.

[9]張瑩，陳帆，馮光榮，等. 蒙自枇杷生長結(jié)果習(xí)性及栽培技術(shù)[J]. 云南農(nóng)業(yè)科技，2009（6）：25-28.

[10]魯海菊，董梅，崔同敏，等. 從枇杷內(nèi)生真菌中篩選抗枇杷根腐病菌的活性菌株[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：95-97.

[11]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：57-125.

[12]魯海菊，郝小燕，崔同敏，等. 抗枇杷根腐病病菌的枇杷主干內(nèi)生真菌生物學(xué)特性研究[J]. 北方園藝，2014（8）：108-111.

[13]陳鳳美，劉群，蔣繼宏，等. 銀杏內(nèi)生鏈格孢菌GI009生物學(xué)特性研究[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報，2005，20（4）：112-114，121.

[14]孫梅青，陳忠，喻其林，等. 鹿蹄草屬內(nèi)生真菌生物學(xué)特性研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（4）：125-128.

[15]葉利芹，吳小芹，王靚. 竹葉銹病重寄生菌赭紅枝頂孢（Acremonium salmoneum）培養(yǎng)條件的研究[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，36（2）：64-68.

[16]葉利芹，吳小芹，葉建仁. 赭紅枝頂孢Acremonium salmoneum對竹葉銹病菌的重寄生作用研究[J]. 中國生物防治學(xué)報，2011，27（4）：528-534.

[17]宋麗雯. 頂孢霉菌株（Acremonium hansfordii）的生物學(xué)特性和對蚜蟲致病機理的研究[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006：1-56.

[18]王琰. 10%頂孢霉（Acremonium hansfordii）可濕性粉劑加工工藝及藥效評價[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010：1-55.

[19]黎起秦，羅寬，林緯，等. 內(nèi)生菌B47的定殖能力及其對番茄青枯病的防治作用[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，2006，33（4）：363-368.

[20]江木蘭，趙瑞，胡小加，等. 油菜內(nèi)生生防菌BY-2在油菜體內(nèi)的定殖與對油菜菌核病的防治作用[J]. 植物病理學(xué)報，2007，37（2）：192-196.

[21]李紅剛，馬林，劉慧平，等. 兩株植物內(nèi)生放線菌在植株體內(nèi)定殖能力的測定[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，28（3）：287-289.

[22]印敬明，劉曉光，萬慧，等. 螺旋毛殼（Chaetomium spirale）ND35防病促生作用初探[J]. 萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2006，23（4）：272-275，279.吳秀臣，蘆建國. 南京城區(qū)綠地的外來入侵植物[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（9）：169-172.