王豐等

摘要：以長白山有毒真菌毒蠅鵝膏菌為原料，研究其活性成分的超聲波提取工藝和抑菌性，確定了其最佳提取工藝條件：丙酮質量濃度85%，料液比1 g ∶25 mL，浸提溫度20 ℃，浸提時間40 min。其中，丙酮質量濃度是影響提取率的主要因素。毒蠅鵝膏菌提取液對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌均有明顯的抑菌效果，最低抑菌濃度是0.062 5%；對酵母、青霉、米根霉、黑曲霉抑菌效果不明顯。

關鍵詞：長白山有毒真菌；有效成分；提??；抑菌

中圖分類號： S482.2+92文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0177-03

有毒真菌是含有對人或動物有毒成分的真菌的總稱，一般是指大型真菌的子實體被人或動物食用后產生中毒反應的物種。據(jù)不完全統(tǒng)計，世界上已知具較明顯毒性的大型真菌有400多種，如包括有輕微毒性的，則有1 000多種，中國目前包括懷疑有毒在內的大型有毒真菌有421種。近年來，傳統(tǒng)化學農藥面臨嚴峻的挑戰(zhàn)，大量高毒、高殘留農藥被禁止使用，開發(fā)對有害生物高效、易分解、且分解產物對環(huán)境無損害的生物農藥是目前廣泛研究和應用的領域。利用天然植物中具有良好抑菌殺菌活性的物質來防治農林病蟲害成為農藥學研究的熱點[1]。據(jù)相關資料反映，大多數(shù)研究的是有毒真菌的殺蟲效果，國內外比較少有關于抑菌效果的研究。筆者對長白山有毒真菌有效成分的提取工藝及抗菌特性進行了研究，旨在為有毒真菌提取物在農林業(yè)生產實踐即植物源抑菌劑中的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，也為有毒真菌的開發(fā)開辟一條新途徑。

1材料與方法

1.1試驗材料與儀器

供試菌種：枯草桿菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌、青霉、黃曲霉、黑曲霉，來自吉林農業(yè)科技學院實驗室。

有毒真菌：毒蠅鵝膏菌，采集于吉林省白山市八道江鎮(zhèn)長白山原始林區(qū)。

試驗儀器：722型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；電子恒溫水浴鍋；高溫高壓蒸汽滅菌鍋等。

主要試劑：乙醇、三氯甲烷、丙酮、石油醚、牛肉膏、蛋白胨等，均為分析純。

1.2試驗方法

1.2.1殺蟲活性物質提取工藝在單因素試驗的基礎上，選定料液比、提取溫度、提取時間3個參數(shù)為主要影響因素，每個因素取3個水平，采用3因素3水平L9（33）正交試驗設計，找到超聲輔助丙酮提取最佳工藝[2-3]，因素及水平設計見表1。

1.2.2真菌提取液的抑菌性測定將7種供試菌種分別制

表1殺蟲活性物質提取工藝正交試驗因素水平

水平因素A：料液比（g ∶mL）B：溫度（℃）C：時間（min）11 ∶25202021 ∶20303031 ∶154040

成菌懸液。采用濾紙片法測定抑菌性：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上分別涂布0.2 mL的金黃葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌菌懸液，PDH培養(yǎng)基平板上分別涂布0.2 mL米根霉、青霉、酵母、黑曲霉懸液，然后將滅菌濾紙片浸在提取液中，放入培養(yǎng)皿中，做3～4個平行，細菌置培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng) 24 h，霉菌置培養(yǎng)箱中35 ℃培養(yǎng)24 h后，測量濾紙片抑菌圈直徑大小。抑菌圈越大，抑菌效果越好。

2結果與分析

2.1料液比對提取率的影響

稱取真菌粉末1.00 g，加入85%丙酮，料液比分別為 1 g ∶10 mL、1 g ∶ 15 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL，40 ℃水浴中超聲波輔助提取，頻率為24 kHz，提取時間為30 min，在 35 ℃ 旋轉蒸發(fā)儀中減壓蒸餾，過濾，定容50 mL。分別取提取液1 mL置于分光光度計352 nm波長下測吸光度，研究料液比對提取效果的影響，結果見圖1。從圖1可知，隨著料液比的增大，吸光度不斷提高，而料液比 1 g ∶25 mL 時與 1 g ∶30 mL 時的提取率沒有顯著差異。從節(jié)約成本方面考慮，本試驗選擇了1 g ∶25 mL的料液比。

2.2提取時間對提取率的影響

稱取真菌粉末1.00 g，加入85%丙酮，料液比為1 g ∶20 mL，提取時間分別為10、20、30、40、50、60、70 min，在20 ℃水浴中超聲波輔助提取，頻率為24 kHz。分別取提取液1 mL置于分光光度計352 nm波長下測其吸光度，研究提取時間對提取效果的影響，結果見圖2。由圖2可以看出，提取時間為40 min時，提取效果最好。提取時間低于40 min時，隨著提取時間的延長，吸光度逐漸增大；提取時間高于40 min時，提取液的吸光度基本沒有變化。提取時間為70 min時，吸光度下降到0.374。因此確定超聲輔助提取時間為40 min。

2.3提取溫度對提取率的影響

稱取真菌粉末1.00 g，加入85%丙酮，料液比為 1 g ∶20 mL，分別于10、15、20、25、30 ℃水浴中超聲波輔助提取，頻率為24 kHz，提取時間為40 min，分別取提取液1 mL置于分光光度計352 nm波長下測其吸光度，研究提取溫度對提取效果的影響，結果見圖3。由圖3可以看出，20 ℃時其吸光度達最高，當溫度超過20℃后，提取液的吸光度開始平緩下

降。在超聲條件下，提取液在較低的提取溫度條件下即可溶出，因此，提取溫度以20 ℃效果最好。

2.4正交試驗結果

由于料液比、提取溫度、提取時間因素對試驗結果影響顯著，故選擇料液比（A）、溫度（B）、時間（C）進行正交試驗，結果見表2。根據(jù)極差分析可以得出，3種因素對提取效果影響大小依次為A>C>B，即料液比對提取效果影響最大，其次為提取時間，提取溫度影響最小。由此可確定最佳提取工藝條件為A1B1C3，即料液比為 1 g ∶25 mL、提取溫度為20 ℃、提取時間為40 min。

表2正交試驗結果

試驗號ABCD352 nm11110.38721220.38131330.38442130.38252210.37662320.38373120.37883230.38293310.377k10.3840.3820.380 k20.3810.3800.381k30.3790.3810.383R0.0050.0020.003

2.5抑菌作用

提取液對金黃葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌效果，對酵母、青霉、米根霉、黑曲霉抑菌效果很弱。然后用濃縮液對4種霉菌做抑菌性試驗，抑菌效果仍然不明顯?？梢詳喽?，毒蠅鵝膏菌提取液的抑菌性：金黃葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌，對4種霉菌抑菌性不明顯（表3）。

2.6最低抑菌濃度（MIC）的確定

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基滅菌后，在其還未凝固時，在無菌操

表3真菌提取液對7種指示菌的抑菌效果

供試菌種抑菌圈直徑（mm）重復1重復2重復3重復4均值金黃色葡萄球菌2425242324大腸桿菌1821201819.25枯草芽孢桿菌21.52321.52222米根霉6676.56.375青霉65645.25酵母60001.5黑曲霉66776.5

作臺中用滅菌的量筒配制含0.031 25%、0.062 5%、0125%、0.25%、0.5%、0.1%、5%的毒蠅鵝膏菌提取液，抑菌試驗操作方法同上，用枯草芽孢桿菌涂布，30 ℃培養(yǎng)24 h之后觀察菌落生長情況，其他2種細菌以同樣的方法測定。由表4、5、6可見，和對照組相比，0.062 5%濃度時菌落明顯減少；0.25%濃度時，沒有菌落出現(xiàn)；0.031 25%以下菌落數(shù)目和對照組相比沒有明顯減少。因而得出結論：毒蠅鵝膏菌提取液對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌的最低抑菌濃度是0.062 5%。

表4對枯草芽孢桿菌的MIC試驗結果

濃度

（%）菌落生長情況1號2號3號0++++++++++++0.031 25++++++++++++0.062 5++++++0.125-+-0.25---0.5---1---5---

表5對大腸桿菌的MIC試驗結果

濃度

（%）菌落生長情況1號2號3號0++++++++++++0.031 25++++++++++++0.062 5+++++++0.125-+-0.25+--0.5---1---5---

表6對金黃葡萄球菌的MIC試驗結果

濃度

（%）菌落生長情況1號2號3號0++++++++++++0.031 25+++++++++++0.062 5+++++0.125---0.25---0.5---1---5---注：“+”為陽性，有菌生長；“-”為陰性，無菌生長。

2.7提取物的耐熱性

將真菌提取液沸水浴5、10、20、30、40、50、60 min，每個時間點用金黃葡萄球菌做指示菌，用濾紙片法做抑菌性試驗，3個平行。如圖4、圖5、圖6所示，真菌提取液沸水浴1 h之后，其抑菌圈大小和對照組相比變化不大，說明提取物中的抑菌物質耐熱性很強，即溫度對提取物抑菌效果沒有明顯的影響。

3結論與討論

本研究結果表明，超聲波輔助丙酮提取毒蠅鵝膏菌有效成分最佳提取工藝為：提取時間為40 min，提取溫度為20 ℃，料液比為1 g ∶25 mL。本試驗采用超聲波輔助法提取真菌提取液，影響提取效果的因素還有很多，如其他提取方法、提取劑、粉碎度、提取次數(shù)等，該試驗的進行可以為進一步研究及實現(xiàn)產業(yè)化提供技術支持。毒蠅鵝膏菌提取液對金黃葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌效果，對酵母、青霉、米根霉、黑曲霉抑菌效果不明顯。

參考文獻：

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