錢　瑛

·中藥園地·

HPLC法在附子炮制中雙酯型生物堿測定的應(yīng)用價值

錢瑛

目的 探討高效液相法（HPLC）在附子與其炮制品中雙酯型生物堿含量測定的應(yīng)用及效果。方法 生附子與其炮制品采用10%氨水浸潤，乙醚超聲提取的方法；色譜柱為Agilent Zorbax Ex tend-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為乙腈-0.2%冰醋酸（比例28∶72，pH為7.29），檢測波長為235nm。結(jié)果 生附片中烏頭堿類生物堿的含量以次烏頭堿最高，新烏頭堿次之，而烏頭堿最低；附子的幾種炮制品中，鹽附子的毒性已經(jīng)明顯降低，而清水黑順片、熟附片（干片蒸制）、熟附片（鮮片蒸制）中僅有微量的毒性成分，而炮附片中主要毒性成分的含量仍較高。結(jié)論 HPLC是一種較好的附子中烏頭類生物堿的提取方法，對附子藥材及其炮制品的質(zhì)量控制和優(yōu)化炮制工藝具有重要的意義。

附子 炮制品 雙酯型生物堿 高效液相色譜法

附子屬于毒性藥材，其主要效用和毒性成分為二萜雙酯類生物堿，包括烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿、塔拉烏頭胺等成分［1］，然而其良好的功效與毒性并存，為減低其毒性，提高臨床療效，通常對附子進行炮制處理，常見炮制品包括黑順片、鹽附子、炮附片、刨附片、熟附片、黃附片等多種炮制品［2］。目前，對附子與其炮制品中雙酯型生物堿含量的測定和質(zhì)量評價方法尚未達到滿意的效果。本資料采用高效液相法（HPLC）探討附子與其炮制品中雙酯型生物堿含量的測定，以了解附子炮制過程中雙酯型生物堿變化，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑 Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司，包括真空脫氣泵、四元泵、自動進樣器、柱溫箱和檢測器）；AG-135精密電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SK 5200H型超聲波提取機（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；PHS-3C型pH值測定儀（上?？祪x儀器有限公司）；烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿，對照品均為定量測定用，購自中國藥品生物制品檢定所，乙腈為色譜純（美國Fisher公司），水為高純水，其他試劑均為分析純。生附片、熟附片（干片蒸制）、清水黑順片、熟附片（鮮片蒸制）、鹽附子、炮附片均購自嵊州市醫(yī)藥藥材總公司。

1.2方法 （1）溶液制備：①生附子與其炮制品溶液制備：分別取生附子與其炮制品粉末適量，粉碎，過40目篩，分別取生附子粉末0.5g，炮制品2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加10%氨水3 ml，濕潤0.5h，再精密加入乙醚25ml，密塞，放置過夜；超聲提取30min，濾紙過濾，再以25ml乙醚分3次沖洗藥渣，過濾，合并濾液和洗液，置50℃水浴揮干乙醚，0.05%鹽酸-甲醇溶液溶解殘渣，并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得樣品溶液。②對照品溶液制備：分別精密稱取烏頭堿2.32 mg，新烏頭堿2.16mg和次烏頭堿對照品2.14mg，置于同一10 ml量瓶中，使用0.01%鹽酸-甲醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。（2）色譜條件［3］：色譜柱為Agilent Zorbax Ex tend-C18（4.6mm×250mm，5μm），柱溫25℃；流動相為A和B兩相梯度洗脫，A為乙腈，B為40mmol/L乙酸銨緩沖液（濃氨水pH為10.0）；乙腈-0.2%冰醋酸（比例28：72，pH為7.29），體積流量1ml /min；檢測波長為235nm，進樣量均為20μl。理論板數(shù)根據(jù)烏頭堿峰計算≥3000。據(jù)此條件，供試品及對照品色譜分離度良好。（3）標準曲線制備：分別精密吸取生附子與其炮制品溶液、對照品溶液各1、2、4、6、8、10、12μl，注入液相色譜儀，分別測定峰面積積分值。分別以烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對照品的進樣量為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），進行線性回歸計算，得到回歸方程。（4）精密度實驗：精密吸取對照品溶液8μl，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定，連續(xù)進樣5次，記錄各自的峰面積，并計算其平均加樣回收率（RSD）值。（5）穩(wěn)定性試驗：精密吸取供試品溶液10μl，進樣1次/2h，即分別在0、2、4、6、8h進樣，測定雙酯型生物堿的峰面積積分值，觀察樣品溶液在檢測過程中待測成分的穩(wěn)定性。（6）重復(fù)性試驗：精密稱取生附子樣品粉末（過40目篩）2g，共取5份，制備供試品溶液并行HPLC測定，分別計算烏頭堿、新烏頭堿及次烏頭堿的量。（7）加樣回收率試驗：精密稱取生附片粉末（過40目篩）1g，共5份，每份用于一種生物堿的回收率測定，分別精密加入新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿對照品適量，制備成供試品溶液，在上述色譜條件下進行HPLC分析，根據(jù)測得量和加入量計算其回收率。（8）樣品含量測定：分別精密稱取待測樣品粉末（過40目篩）2g，按上述方法配置成供試品溶液，注入液相色譜儀，進樣10μl，記錄色譜圖，計算各供試品溶液中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的含量。

2　結(jié)果

2.1烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿線性回歸方程 見表1。

表1　烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿線性回歸方程

2.2精密度實驗結(jié)果 烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的RSD分別為0.68%、0.72%、0.40%，表明儀器精密度良好。

2.3穩(wěn)定性實驗結(jié)果 烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD分別為0.65%、0.43%、0.76%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定，可以滿足測定需要。

2.4重復(fù)性試驗結(jié)果 烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的平均質(zhì)量分數(shù)分別為0.1750mg/g、0.5071mg/g和0.2285 mg/g，RSD分別為1.06%、1.57%和1.75%，表明測定方法的重復(fù)性較好。

2.5加樣回收率試驗結(jié)果 烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的RSD分別為97.35%（1.16%）、97.20%（1.36%）和97.70%（1.52%）。

2.6樣品含量測定結(jié)果 見表2。

表2　生附片及5種炮制品的含量測定結(jié)果

3　討論

在附子的雙酯型生物堿分子結(jié)構(gòu)中有一個乙酞基和一個苯甲酞基，此兩個酯基是雙酯型生物堿的主要毒性基團，在炮制加工濕熱的狀態(tài)下，雙酯型生物堿酯鍵容易水解去掉一個酯基而轉(zhuǎn)化成低毒的單酯型生物堿［4］，如苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰新烏頭原堿，或繼續(xù)水解去掉兩個酯基轉(zhuǎn)化為低毒的烏頭原堿［5］。截至目前，我國有20多種關(guān)于附子的炮制方法，多為煎煮和蒸制的方式，以求達到揚其療效、抑其毒性的目的。但是，由于生物堿既為藥理成分又為毒性成分，因此炮制不足則附子中雙酯型生物堿含量過高易導(dǎo)致用藥中毒，炮制過度則雙酯型生物堿完全水解，難于保證臨床療效［6］。因此，要求在附子的炮制過程中應(yīng)建立能同時兼顧附子安全性和有效性的科學(xué)、量化的質(zhì)量控制標準。由于附子在我國有比較廣泛的分布，加之原藥材規(guī)格及炮制方法差異較大，因此附子及其炮制品的質(zhì)量存在一定的差異［7］。2005年版《中國藥典》采用HPLC法對附子中的烏頭堿含量進行了測算［8］，但這并不能全面而準確地反映附子藥材中的藥效成分。

在資料中，在200～400 nm范圍內(nèi)對烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對照品溶液進行掃描，結(jié)果顯示此3種溶液在235 nm處均有較好的吸收峰，因此選用235 nm作為本研究中各受試樣品的檢測波長。在提取方法的考察方面，則主要參照了文獻的通用標準方法，即根據(jù)附子的性質(zhì)，采用氨水浸潤，乙醚超聲法進行提取。另外結(jié)果顯示，生附片中烏頭堿類生物堿的含量以次烏頭堿最高，新烏頭堿次之，而烏頭堿最低；附子的幾種炮制品中，3種生物堿含量均較低或檢測不到，充分說明了炮制減毒的目的。幾種炮制品中，鹽附子基本檢測不到烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿；清水黑順片、熟附片（干片蒸制）、熟附片（鮮片蒸制），僅能檢測到少量的次烏頭堿；炮附片除次烏頭堿外，仍能檢測到較高含量的新烏頭堿。這說明生附片經(jīng)過炮制后，鹽附子的毒性已明顯降低，而清水黑順片、熟附片（干片蒸制）、熟附片（鮮片蒸制）中僅有微量的毒性成分，而炮附片中主要毒性成分的含量仍較高。HPLC使附子的3種雙酯型生物堿均得到了較好的分離，可見HPLC法在附子與其炮制品中雙酯型生物堿測定中具有方法簡便快速、靈敏準確，實驗結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，專屬性強，且成本低、效率高的特點，RSD能達到定量的要求，是一種較好的附子中烏頭類生物堿的提取方法，對附子藥材及其炮制品的質(zhì)量控制和優(yōu)化炮制工藝具有重要的意義。

1 越皓,皮子鳳,宋鳳瑞,等.附子不同配伍藥對中生物堿成分的電噴霧質(zhì)譜分析.藥學(xué)學(xué)報,2007,42（2）： 201～205.

2 吳超,趙翡翠,姜林.新疆準噶爾烏頭及其炮制品的急性毒性和鎮(zhèn)痛作用研究.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,35（2）：197～201.

3 黃志芳,易進海,陳東安.制川烏HPLC特征圖譜研究和6種酯型生物堿的含量測定.藥物分析雜志,2011,31（2）：217～221.

4 孫蘭,周海燕,趙潤懷.HPLC法同時測定附子中6種單酯和雙酯型生物堿.中草藥,2009,40（1）：131～134.

5 劉文龍,劉志強,宋鳳瑞,等.烏頭類雙酯型生物堿組分轉(zhuǎn)化為單酯水解型及脂型生物堿組分的研究.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報,2011,32（3）：717～720.

6 陳東安,易進海,黃志芳.附片指紋圖譜研究及6種酯型生物堿含量測定.中國中藥雜志,2010,35（21）：2829～2833.

7 吳平麗,劉雯,卓超.應(yīng)用高速逆流色譜技術(shù)從附子中分離制備苯甲酰新烏頭原堿.中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2009,11（2）：260～262.

8 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典： 2010 年版第一部.北京： 中國醫(yī)藥科技出版社,2010. 36～37.

312400 浙江省嵊州市人民醫(yī)院