超聲波輔助醇溶劑法提取橙皮苷及體外抑菌活性分析

張啟煥 嚴(yán)新 許偉等

摘要[目的]對柑橘皮中的橙皮苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并且分析其抗菌活性。[方法]采用單因素試驗和正交試驗，對利用超聲波輔助乙醇溶液法提取柑橘皮中橙皮苷的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并且采用平板法檢測提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性。[結(jié)果]獲得的最佳工藝條件為：濃度 50%乙醇堿性溶液，pH 11，提取時間30 min，料液比1∶30（g/ml）。在此條件下，橙皮苷的提取率為2.76%。抑菌試驗顯示，橙皮苷在0.15%～0.50%的濃度下金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有較好的抑菌效果。[結(jié)論]獲得超聲波輔助，氫氧化鈉乙醇溶液法提取橙皮苷的最佳工藝，橙皮苷抑菌效果無種屬特異性，具有廣譜的抑菌活性。

關(guān)鍵詞橙皮苷；提取工藝；抑菌

中圖分類號S609.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）31-033-02

Study on Extraction of Hesperidin from Ponkan Peel and Analysis of Its Bacteriostatic Activity

ZHANG Qihuan1， YAN Xin2， XU Wei1， SHAO Rong1 et al

（1. School of Marine and Biological Engineering， Yancheng Institute of Technology， Yancheng， Jiangsu 224051； 2. School of Chemical and Biological Engineering， Yancheng Institute of Technology， Yancheng， Jiangsu 224051）

Abstract[Objective] To optimize the extracted technology of hesperidin from ponkan peel and analyze its bacteriostatic activity. [Method] The ultrasonicassisted ethanol extraction of hesperidin was optimized by orthogonal test and the bacteriostatic activity against E.coli and Staphylococcus aureus were investigated using plate method. [Result] The optimal ethanol concentration， pH， extraction time and ratio of material to extractant was 50%， 11， 30 min and 1∶30 （g/ml）， respectively. The extraction ration was 2.76%. Bacteriostatic experiments showed that the hesperidin possess perfect bacteriostatic activity against E.coli and S.aureus at concentration of 0.15%-0.5%. [Conclusion] The optimal extraction technology of hesperidin was obtained form ponkan peel. Meanwhile， the bacteriostatic activity of hesperidin was broad and nonspecies related.

Key wordsHesperidin； Extraction technology； Bacteriostatic activity

橙皮苷（Hesperidin，Hsd），又名橙皮甙、陳皮甙，是一種廣泛存在于檸檬、橘、柑和甜橙等的果肉和果皮中的一種天然黃酮類化合物，純品為白色微小針狀晶體，分子式C18H34O15，分子量610.57，熔點258～262 ℃，易溶于吡啶、稀堿溶液，微溶于甲醇和熱冰醋酸，幾乎不溶于乙醚、丙酮、苯和氯仿[1]。

橙皮苷具有抗炎、止痛[2]、免疫抑制[3]及抗癌[4]等活性，已被用于多種疾病的預(yù)防與治療，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用、開發(fā)前景[5-6]，尤其是其抗癌活性已得到眾多研究者的重視。研究表明，橙皮苷可以同時作用于多個細(xì)胞信號通路蛋白，如通過活化caspases，Bcl2（Bcell lymphoma 2）和Bax（Bcl2 assocaited X protein）誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，還可以通過調(diào)節(jié)COX2（cyclooxygenase2）、MMP2（matrix metalloproteinase2）和MMP9抑制腫瘤的血管生成、代謝[7]。

目前，橙皮苷的提取方法主要有溶劑提取法[8-9]、堿提酸沉法[10]、微波法[11]和超聲波法[12]等。但是，由于提取工藝、原料來源及評價指標(biāo)的不同，產(chǎn)物的提取率也不盡相同。尋找一種簡單、經(jīng)濟(jì)、有效的橙皮苷提取工藝對于綜合利用橙皮、減少資源浪費和環(huán)境污染具有重要的意義。因此，筆者探討了超聲波輔助乙醇溶液法提取橙皮苷的工藝條件，并且分析了橙皮苷的抑菌活性，為橙皮苷的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供重要的參考。

1材料與方法

1.1儀器與設(shè)備AUY220型電子分析天平，日本島津股份有線公司；B220型恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；DHG9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；UV752N紫型外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2材料與試劑新鮮柑橘，市售，取皮，置于70 ℃烘箱中干燥；橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（分析純），購于上海金穗生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確稱取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品12 mg，用含0.1%NaOH的75%乙醇充分溶解且定容至50 ml，為溶液1。取30 ml溶液1，定容至50 ml，為溶液2；再取40 ml溶液2，定容至50 ml，為溶液3；然后取40 ml溶液3，定容至50 ml，為溶液4；取40 ml溶液4，定容至50 ml，為溶液5；最后配制成濃度為0.023 6～0.072 0 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液。在362 nm處測定吸光值，并且繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程為y=23.58x-0.209，R2=0.975。

1.3.2橙皮苷提取工藝流程及條件優(yōu)化。橙皮苷的提取工藝流程見圖1。按照該工藝流程固定固液比、乙醇濃度、提取時間、pH和乙醇濃度，分別研究各提取條件對橙皮苷提取率的影響。在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計L9（34）正交試驗，對料液比、乙醇濃度、pH和提取時間等因素對橙皮苷提取率的影響。

1.3.3橙皮苷含量及提取率的測定。取100～200 μl提取液于10 ml試管中，加入堿性乙醇溶液，定容至10 ml，測定樣品，并且以堿性乙醇為空白，在362 nm處測定其吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算橙皮苷的含量、提取率。橙皮苷的提取率計算公式為：

X（%）=C×201 000×0.5×100%

式中，稀釋后的橙皮苷溶液的濃度（μg/ml）。

1.4抑菌試驗分別用PBS將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌配制成OD600為0.1的菌液。取0.2 ml大腸桿菌、金黃色葡萄球菌液，加入到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，立即用涂布棒迅速將菌液均勻涂開。將浸漬過橘皮苷溶液（0.15%、0.30%和0.50%橙皮苷PBS溶液）的濾紙圓片風(fēng)干，放到每個涂有菌液的平板上，在每個培養(yǎng)皿中放4個紙片。每個濃度重復(fù)3個培養(yǎng)皿。細(xì)菌在37 ℃下培養(yǎng)48 h，測定抑菌圈直徑大小，確定抑菌效果。

2結(jié)果與分析

2.1橙皮苷提取的單因素試驗

2.1.1料液比對橙皮苷提取率的影響。取0.5 g橙皮粉，在固定提取時間為30 min、pH為10、超聲功率為200 W的條件下，考察料液比對橙皮苷提取的影響。從圖2可以看出，當(dāng)料液比為20～30 mg/mg時，橙皮苷提取率隨料液比的增加而增加；當(dāng)料液比>30 mg/mg時，提取率增加并不明顯。因此，確定最佳的料液比為1∶30。

2.1.2乙醇濃度對橙皮苷提取率的影響。從圖3可以看出，當(dāng)乙醇濃度為60%時，橙皮苷提取率達(dá)到最高。這主要是由于橙皮苷含有酚羥基，極性化合物易溶于極性溶劑，非極性化合物易溶于非極性溶劑，同類分子或官能團(tuán)相似的彼此互溶。

2.1.3提取時間對橙皮苷提取率的影響。從圖4可以看出，當(dāng)浸提時間在30 min左右時，提取率較高，當(dāng)浸提時間小于30 min或大于30 min時，產(chǎn)率都較低。其原因可能是橘皮苷分子中的酚性輕基在堿液作用下逐漸從橘皮中溶解出來，浸泡時間太短橘皮苷溶解不充分，而浸泡時間過長部分橘皮苷分解，體現(xiàn)橘皮苷在水中的不穩(wěn)定性。

2.1.4pH對橙皮苷提取率的影響。從圖5可以看出，當(dāng)pH 9～12時，橙皮苷的提取率隨溶液pH的增加而逐漸提高，在pH 12時橙皮苷的提取率最高。這可能是由于橙皮苷易溶于堿性溶液，堿性乙醇提取劑更有利于橙皮苷溶解，當(dāng)達(dá)到橙皮苷的最適宜溶解條件時，橙皮苷的提取率明顯提高。當(dāng)溶液pH 12～13時，橙皮苷的提取率趨于平穩(wěn)且略微下降，并且產(chǎn)生有刺激性氣味的氣體。這可能是由于在強(qiáng)堿性提取環(huán)境下，橙皮苷的某些化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得橙皮苷變性，提取率下降。

2.2橙皮苷提取的正交試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計L9（34）正交試驗，優(yōu)化提取時間、pH、料液比和乙醇濃度4個因素，確定最佳提取條件。正交試驗設(shè)計如表1所示。

由表2可知，影響橘皮中橙皮苷提取率的因素依次是提取時間、乙醇濃度、溶液pH、料液比。其中，提取時間是影響橙皮苷提取率的主要因素。通過正交試驗，確定橘皮中橙皮苷提取的最佳工藝條件為A2B1C2D2，即料液比為1∶40，乙