程珍霞　胡海濤

摘要 番茄紅素對(duì)人體的健康有著至關(guān)重要的作用，在清楚高等植物類(lèi)胡蘿卜素生物合成代謝相關(guān)基因的基礎(chǔ)上，利用生物工程手段調(diào)控上游基因的超表達(dá)和下游基因的沉默，以提高番茄紅素的含量已取得了進(jìn)展。

關(guān)鍵詞 番茄紅素；基因表達(dá)調(diào)控；生物工程

中圖分類(lèi)號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）20-027-02

Abstract Lycopene plays an important role in human health.Based on understanding the expression and regulation of carotene genes in higher plants，it is possible to use genetic engineering methods to increase lycopene content by overexpression of upstream gene and interference of downstream gene.

Key words Lycopene； Gene expression and regulation； Genetic engineering

番茄紅素是一種極具潛力的類(lèi)胡蘿卜素化合物，對(duì)人體的健康有著至關(guān)重要的作用。它具有極強(qiáng)的抗氧化能力，可以延緩細(xì)胞和人體的衰老[1]、降低心血管疾病以及某些癌癥的發(fā)病率[2]等。但人體及動(dòng)物自身無(wú)法產(chǎn)生番茄紅素，必須通過(guò)飲食從食物中攝取，人體攝取的番茄紅素中85%來(lái)源于番茄（Solanum lycopersicum）果實(shí)。隨著人口的增長(zhǎng)，人們對(duì)番茄紅素的需求日益上升，因此，尋求高含量番茄紅素的植物種質(zhì)成為當(dāng)下亟需解決的問(wèn)題。

基于類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的研究成果，通過(guò)基因工程手段調(diào)控番茄紅素的生物合成代謝日趨成熟[3]。筆者綜述了國(guó)內(nèi)外對(duì)番茄紅素基因表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展。

1 類(lèi)胡蘿卜素合成代謝相關(guān)基因的克隆

類(lèi)胡蘿卜素是高等植物、真菌和光合微生物中廣泛存在的一種天然C40萜類(lèi)化合物。高等植物的類(lèi)胡蘿卜素主要存在于成色素細(xì)胞，通過(guò)類(lèi)異戊二烯生物途徑合成，始于由八氫番茄紅素合成酶（PSY）催化的2分子牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸（GGPP）向八氫番茄紅素的轉(zhuǎn)化，八氫番茄紅素經(jīng)過(guò)八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）和六氫番茄紅素脫氫酶（ZDS）的4步連續(xù)脫氫形成番茄紅素，在2種番茄紅素環(huán)化酶（LCYb、LCYe）的作用下形成胡蘿卜素，胡蘿卜素經(jīng)過(guò)羥化酶和加氧酶的作用形成種類(lèi)多樣的類(lèi)胡蘿卜素及其他下游代謝產(chǎn)物。

為了從分子水平上理解類(lèi)胡蘿卜素生物合成代謝，人們克隆了類(lèi)胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因。番茄是公認(rèn)的類(lèi)胡蘿卜素生物合成代謝模式植物，其相關(guān)基因是研究最早也是最透徹的。Cunningham等[4]結(jié)合前人的研究成果對(duì)類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的相關(guān)基因和酶進(jìn)行了詳細(xì)總結(jié)。此后，大量物種的類(lèi)胡蘿卜素合成基因相繼被克隆出來(lái)，如柑橘、橙、胡蘿卜、番木瓜等。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)植物類(lèi)胡蘿卜素基因編碼的氨基酸序列在不同的物種間具有較高的保守性。對(duì)相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)分析顯示，盡管在不同的組織基因表達(dá)水平不同，但類(lèi)胡蘿卜素含量及成分的變化與類(lèi)胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平相關(guān)[5]，總體趨勢(shì)為隨著PSY、PDS、ZDS等基因的表達(dá)上調(diào)，類(lèi)胡蘿卜素的總含量及番茄紅素含量隨之上升，而隨著LCYb、LCYe基因的表達(dá)下調(diào)，下游類(lèi)胡蘿卜素的含量會(huì)隨之下降，但上游類(lèi)胡蘿卜素，尤其是番茄紅素的含量則顯著增加。

2 類(lèi)胡蘿卜素基因的表達(dá)調(diào)控

2.1 番茄紅素上游關(guān)鍵基因的超表達(dá)調(diào)控

PSY是類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的限速酶，由細(xì)菌CRTB基因與真核生物PSY基因編碼，調(diào)控PSY的表達(dá)量通常會(huì)引起類(lèi)胡蘿卜素成分及含量的變化。將CRTB基因轉(zhuǎn)入胡蘿卜（Daucus carota），類(lèi)胡蘿卜素提高了2～5倍[6]。在油菜（Brassica campestris）種子中特異性超表達(dá)CRTB基因，獲得的轉(zhuǎn)基因胚乳呈黃色，類(lèi)胡蘿卜素含量上升了50倍，種子出現(xiàn)輕微萌發(fā)延遲現(xiàn)象[7]。在番茄果實(shí)中特異性超表達(dá)CRTB基因，PSY總活性上升了5～10倍，總類(lèi)胡蘿卜素含量上升了2～4倍[8]。在2個(gè)品種的土豆（Solanum tuberosum）塊莖中特異性表達(dá)CRTB基因，轉(zhuǎn)基因土豆的β胡蘿卜素和葉黃素含量均大量上升[9]。在亞麻（Linum usitatissimum）中分別組成型和種子特異性超表達(dá)CRTB，結(jié)果組成型超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中CRTB基因也只在種子中表達(dá)，類(lèi)胡蘿卜素總量達(dá)到65.4～156.3 μg/g鮮重，還積累了大量八氫番茄紅素、α胡蘿卜素和β胡蘿卜素[10]。在番茄中超表達(dá)CRTB基因，獲得的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中八氫番茄紅素的含量增加了1.8倍，類(lèi)胡蘿卜素總量增加1.3～2.5倍[11]。 在番茄中組成型表達(dá)PSY基因，導(dǎo)致種皮、子葉、果實(shí)等多個(gè)器官的類(lèi)胡蘿卜素含量發(fā)生變化，同時(shí)赤霉素含量下降了30倍，引起轉(zhuǎn)基因番茄植株的矮化現(xiàn)象[12]。在水稻（Oryza sativa）胚乳中分別進(jìn)行組成型和胚乳特異性超表達(dá)水仙PSY，結(jié)果轉(zhuǎn)基因胚乳中只有特異性表達(dá)的胚乳能且僅能檢測(cè)到八氫番茄紅素[13]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子中特異性超表達(dá)其內(nèi)源PSY基因，獲得的轉(zhuǎn)基因種子β胡蘿卜素含量上升了43倍，葉黃素、紫黃質(zhì)、葉綠素和脫落酸的含量也顯著上升，種子出現(xiàn)休眠現(xiàn)象[14]。在番茄果實(shí)中組成型表達(dá)歐李（Cerasus humilis）PSY 基因，獲得的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中總類(lèi)胡蘿卜素含量增加了1.62～3.04 倍[15]。

PDS是將八氫番茄紅素經(jīng)過(guò)連續(xù)的2步脫氫轉(zhuǎn)變?yōu)榱鶜浞鸭t素的酶，是類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑中的另一重要酶。在煙草中組成型表達(dá)臘梅（Chimonanthus praecox）PDS基因，結(jié)果轉(zhuǎn)基因煙草中番茄紅素含量均高于野生型對(duì)照組[16]。在番茄中超表達(dá)番茄PDS基因，獲得的轉(zhuǎn)基因株系果實(shí)中的番茄紅素產(chǎn)量提高了1.4倍[17]。在小麥（Triticum aestivum）胚乳中特異性表達(dá)玉米y1（編碼PSY）和CRTI基因，轉(zhuǎn)基因小麥的總類(lèi)胡蘿卜素含量上升了10.8倍[18]。在小麥中同時(shí)表達(dá)CRTB和CRTI基因，種子干重的總類(lèi)胡蘿卜素含量提高了近8倍，β胡蘿卜素含量提高了65倍，維生素A前體含量提高了76倍[19]。

這些試驗(yàn)結(jié)果均表明，在植物中超表達(dá)PSY、PDS等基因，能改變類(lèi)胡蘿卜素含量及成分，但是不同的物種其變化類(lèi)胡蘿卜素種類(lèi)及程度不同，可能因?yàn)槲锓N本身的類(lèi)胡蘿卜素生物合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平及酶活性不同導(dǎo)致結(jié)果的巨大差異。從這些研究中還發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)的基因來(lái)自高等植物比來(lái)自原核生物的好，特異性超表達(dá)比組成型表達(dá)效果更好，選擇的受體物種中類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因表達(dá)量及酶活高的比不具有或基因表達(dá)量及酶活低的物種效果好。

2.2 番茄紅素下游代謝基因的干擾調(diào)控

要提高番茄紅素積累，理論上需要下調(diào)下游關(guān)鍵基因LCYb、LCYe的表達(dá)以降低其對(duì)番茄紅素的利用。利用2個(gè)反向LCYb、LCYe片段間插入GUS A基因構(gòu)成干擾載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化番茄，導(dǎo)致類(lèi)胡蘿卜素含量明顯變化，證明RNA干擾（RNAi）技術(shù)是提高植物番茄紅素含量的有效方法[20]。將番茄LCYb、LCYe基因構(gòu)建成正、反義干擾表達(dá)載體，結(jié)果轉(zhuǎn)基因番茄中番茄紅素的含量均有不同程度的上升[21]。通過(guò)RNAi 阻斷LCYb基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控番茄紅素的積累，獲得的轉(zhuǎn)基因植株中番茄紅素的含量最高可達(dá)13.84 μg/g鮮重，是對(duì)照組的4.26倍[22]。通過(guò)控制反義LCYb基因在番茄果實(shí)中特異性表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因番茄中平均番茄紅素含量上升了2.1倍[23]。將擬南芥LCYb構(gòu)建成果實(shí)特異性反義干擾載體，獲得的轉(zhuǎn)基因株系中LCYb基因表達(dá)水平下調(diào)了近1倍，導(dǎo)致番茄紅素含量上升[24]。使LCYe在土豆塊莖中特異性沉默，結(jié)果β胡蘿卜素含量顯著上升14倍，總類(lèi)胡蘿卜素含量上升2.5倍[25]。這些研究結(jié)果均表明，干擾下游基因的表達(dá)可以提高番茄紅素的含量。

隨著基因表達(dá)調(diào)控研究的深入，在單獨(dú)調(diào)控的基礎(chǔ)上，衍生出將番茄紅素的上游超表達(dá)和下游干擾相結(jié)合的方式，同時(shí)調(diào)控番茄紅素的生物合成。通過(guò)果實(shí)特異性啟動(dòng)子將擬南芥PSY 基因和番茄LCYb基因RNAi 片段構(gòu)建在同一表達(dá)載體中，為獲得高含量的番茄紅素提供了新的技術(shù)平臺(tái)[26]。

3 結(jié)語(yǔ)

在植物中超表達(dá)類(lèi)胡蘿卜素生物合成PSY、PDS等上游基因，或者借助反義、RNAi等技術(shù)引起下游基因的沉默，實(shí)現(xiàn)了類(lèi)胡蘿卜素特定成分含量的變化，為通過(guò)基因調(diào)控手段提高番茄紅素含量提供了理論依據(jù)和有效的技術(shù)平臺(tái)。

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