胡蘭 余敏君 胡新年 江濤 劉莎 王建平

摘要：目的：觀察西格列汀誘導糖尿病大鼠腎臟表達血紅素氧合酶-1（HO-1）表達的影響。方法 ： 選取SPF級雄性SD大鼠40只，給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，隨后模型組大鼠采STZ（30mg/kg）腹腔注射以建立糖尿病腎病大鼠模型，將造模成功的大鼠隨機分為對照組（n=10）、低劑量[1mg/（kg·d），n=10]和高劑量[10mg/（kg·d），n=10]西格列汀干預組，10周后，獲取大鼠腎組織，Western blot檢測HO-1蛋白表達水平，實時定量PCR檢測mRNA表達，比色法分析HO-1酶活性。結果：與陰性對照組相比，模型組大鼠中HO-1蛋白表達水平、mRNA水平以及HO-1酶活性有輕度增高。而采用不同濃度的西格列汀干預后HO-1蛋白表達水平、mRNA水平以及HO-1酶活性進一步增加，并呈一定的劑量依賴性。結論：西格列汀能上調(diào)糖尿病大鼠腎臟表達HO-1。

關鍵詞： 西格列??；紅素氧合酶-1；糖尿病

糖尿病腎病是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，是導致終末期腎衰竭的重要原因。其發(fā)病機制十分復雜，目前大量的證據(jù)表明糖尿病引起的氧化應激與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。生理條件下，機體在應對氧化應激產(chǎn)生的活性氧（ROS）損害時形成了一套復雜的抗氧化應激應答防御系統(tǒng)，即當暴露于ROS時，機體自身能通過誘導表達一系列保護性蛋白，來緩解組織細胞遭受的損害。血紅素氧合酶（heme oxygenase，HO）-1是血紅素降解的起始酶以及限速酶，是一種具有拮抗氧化應激作用的抗氧化酶，是細胞氧化應激過程中的一個敏感指標。在生理狀態(tài)下，腎臟中僅腎髓質(zhì)低水平表達HO-1，但在糖尿病等病理狀態(tài)下，HO-1受誘導表達水平增高，從而發(fā)揮抗氧化、抗炎癥的效應。近年來有研究發(fā)現(xiàn)西格列汀具有潛在的大血管保護作用，為糖尿病大血管病變的防治開辟了新的治療途徑。研究顯示西格列汀可通過激活環(huán)磷酸腺苷途徑減少AGE的形成，抑制NF-κB的激活，以減少血管內(nèi)皮細胞炎癥因子的表達，來發(fā)揮血管保護作用。本實驗利用高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射的方法建立糖尿病腎病大鼠模型，觀察西格列汀對HO-1表達的有何影響，從而探討其對血管保護作用的可能機制。

1材料與方法

1.1主要實驗材料

鏈脲佐菌素（STZ）購自美國Sigma公司，TRIZol 購自Invitrogen 公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒從Fermentas公司購買；血紅素氧合酶-1活性試劑盒上海GENMED公司；RIPA裂解液、ECL試劑盒購自Thermo；鼠抗人HO-1購自Cell Signaling。

1.2 模型的建立

65只健康清潔級雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，3月齡，體重180-220g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。實驗前于一般飼料條件下喂養(yǎng)大鼠l周以適應環(huán)境，測量大鼠血糖保證其在正常的范圍內(nèi)。隨機選取15只大鼠作為正常對照組（NC組），給予NC組普通飼料喂養(yǎng)直到研究結束。剩下的50只大鼠用作糖尿病造模組，給予高糖高脂的飼料（普通飼料加入10%熟豬油、10%蔗糖、0.2%膽酸鈉、2%膽固醇）共4周（每日熱量不限）。在造模組和正常組中各隨機取出15只大鼠，稱重后將其禁食12h，于大鼠的右眼眶后靜脈叢進行取血，取1.5～2ml置于4℃的條件下進行自然凝聚。隨后以3000rpm離心5min，移取上清液進行空腹胰島素和空腹血糖檢測，計算出胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），確認造模組的大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗以后，對其進行禁食，12h后通過腹腔內(nèi)注射給予鏈脲佐菌素（STZ），劑量是30mg/kg，在冰浴下用0.1mmol/L的無菌的枸櫞酸鈉緩沖液配制1%STZ溶液，并將其調(diào)為PH4.4，于4℃條件下保存，注意要現(xiàn)用現(xiàn)配。為正常組大鼠腹腔注射對應體積的無菌枸櫞酸鈉緩沖液。72h后對大鼠行尾靜脈取血以檢測血糖，若血糖濃度不足16.7mmol/L，再次對其腹腔內(nèi)注射STZ，20mg/kg。若大鼠不同日的三次隨機血糖濃度不低于16.7mmol/L，將其選為糖尿病模型。進行眶內(nèi)靜脈取血操作時，有2只造模組大鼠由于麻醉及取血操作的問題死亡，還有1只大鼠造模失敗，最后共有47只大鼠糖尿病造模成功。

1.3 HO-1蛋白表達檢測

模型建立10周后處死大鼠，獲取腎臟組織并制成勻漿，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液充分裂解組織，4℃ 12，000 rpm離心10 min，獲取上清用于實驗。細胞總蛋白的提取試劑盒嚴格按照說明書使用。將前面提取出的蛋白進行蛋白定量以后，取等量蛋白裂解液于10%-12%的SDS-PAGE上進行電泳及轉(zhuǎn)膜，然后置于5%無脂奶粉中，進行封閉1h，再加入適當稀釋比例的一抗于4℃條件下孵育過夜，加適量稀釋的二抗于37℃條件下孵育1h，用ECL試劑進行顯影。

1.4 HO-1 mRNA表達分析

用TRIzol試劑提取細胞總RNA，并取3μg的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。引物信息如下：HO-1上游引物：5- CGTGCAGAGAATTCTGAGTTC -3′，HO-1下游引物： 5′- AGACGCTTTACGTAGTGCTG -3′； β-actin上游引物： 5′- CCTGTATGCCTCTGGTCGTA -3′， β-actin下游引物： 5′- CCATCTCTTGCTCGAAGTCT -3′，將獲得的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進行Realtime-PCR。定量PCR擴增程序如下：50℃ 2 min，隨后進入95℃10 min，最后進行95℃ 15 s，58℃ 1 min共40個循環(huán)，結果以相對表達量表示。

1.5 HO-1酶活性分析

將獲取的組織上清至1.5 mL的EP管中（可分多次收集），1，000 rpm離心8 min，棄上清，加1.5 mL的GENMED清理液A去清洗細胞，1，000 rpm離心8 min，棄上清，瀝干，將EP管放置冰上，加入100 μL GENMED裂解液B，充分混勻，超聲裂解細胞，（超聲條件：振幅14 nm，10 s，間隔15 s，重復3～5次）。最后將裂解液置于4℃，10，000 rpm離心15 min，吸取上清放置另一新的EP管中，按照試劑盒提供的操作步驟，計算出血紅素氧合酶-1的活性，結果以相對活性表示（模型組活性/對照組活性×100%）。

1.6統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用±SD表示，并采用One-Way ANOVA方法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。P<0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 西格列汀對HO-1蛋白表達的影響

西格列汀對HO-1蛋白表達的影響見表1。

表1 西格列汀對HO-1蛋白表達的影響

與陰性對照組相比，模型組大鼠中HO-1蛋白表達水平有一定提高。用高劑量西格列汀干預后，HO-1蛋白表達水平比低劑量西格列汀干預組進一步增加，呈一定的劑量依賴性。

2.2 西格列汀對HO-1 mRNA表達的影響

西格列汀對HO-1 mRNA表達的影響見表2。

表2 西格列汀對HO-1 mRNA表達的影響

與陰性對照組相比，模型組大鼠中HO-1 mRNA表達水平有一定提高。用高劑量西格列汀干預后，HO-1 mRNA表達水平比低劑量西格列汀干預組進一步增加，呈一定的劑量依賴性。

2.3西格列汀對HO-1酶活性的影響

西格列汀對HO-1酶活性的影響見表2。

表2 西格列汀對HO-1酶活性的影響

與陰性對照組相比，模型組大鼠中HO-1酶活性有一定提高。用高劑量西格列汀干預后，HO-1酶活性比低劑量西格列汀干預組進一步增加，呈一定的劑量依賴性。

3討論

糖尿病是一種常見的代謝疾病群，糖尿病的并發(fā)癥有100多種，是目前已知疾病當中并發(fā)癥最多的，糖尿病腎病是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，是導致終末期腎衰竭的重要原因[1]。胰島素作用缺陷或（和）胰島素分泌缺陷導致高血糖。高血糖和繼發(fā)的脂代謝紊亂會導致糖尿病患者體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧簇（reactive oxygen species ，ROS）增多，同時機體清除活性氧簇系統(tǒng)的功能降低，氧化級抗氧化功能間失衡[2]。生理條件下，機體在應對氧化應激產(chǎn)生的活性氧（ROS）損害時形成了一套復雜的抗氧化應激應答防御系統(tǒng)，即當暴露于ROS時，機體自身能通過誘導表達一系列保護性蛋白，來緩解組織細胞遭受的損害[3]。目前，拮抗氧化應激在糖尿病慢性并發(fā)癥的防治方面具有重大意義。

血紅素氧合酶（heme oxygenase，HO）-1是血紅素降解的起始酶以及限速酶，是細胞氧化應激過程中的一個敏感指標[4]。在生理狀態(tài)下，腎臟中僅腎髓質(zhì)低水平表達HO-1，但在糖尿病等病理狀態(tài)下，HO-1受誘導表達水平增高，從而發(fā)揮抗氧化、抗炎癥的效應[5]。糖尿病患者的腎組織中產(chǎn)生的ROS過多，HO-1受到較強的誘導[6]。本研究利用高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射的方法建立糖尿病腎病大鼠模型。糖尿病動物模型包括人工誘發(fā)以及遺傳自發(fā)兩類，人工誘發(fā)是指為四氧嘧啶（alloxan）或大鼠注射鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）等藥物誘導其產(chǎn)生糖尿病[7]。STZ對動物胰島B細胞的損害存在較高的特異性，故廣泛應用于糖尿病動物模型的復制。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)西格列汀具有潛在的大血管保護作用，為糖尿病大血管病變的防治開辟了新的治療途徑，西格列汀可通過激活環(huán)磷酸腺苷途徑減少AGE的形成，抑制NF-κB的激活，以減少血管內(nèi)皮細胞炎癥因子的表達，來發(fā)揮血管保護作用[8]。本研究以糖尿病腎病大鼠模型為研究對象，觀察西格列汀對HO-1表達的有何影響。結果表明：與陰性對照組相比，模型組大鼠中HO-1蛋白表達水平、mRNA水平以及HO-1酶活性有輕度增高。而采用不同濃度的西格列汀干預后HO-1蛋白表達水平、mRNA水平以及HO-1酶活性進一步增加，并呈一定的劑量依賴性。有研究表明，HO-1上調(diào)可以使得胰島素抵抗改善，血清脂聯(lián)素的水平提高，胰島素敏感性增強，肝臟 MDA 水平減少，HO-1上調(diào)具有抗糖尿病的功效[9]。HO-1可以有效抗氧化，它能夠增強過氧化氫酶以及細胞外超氧化物歧化酶的活性，降低上皮細胞的凋亡，減少超氧陰離子形成[10]。

綜上所述，西格列汀能上調(diào)糖尿病大鼠腎臟表達HO-1，對糖尿病的治療具有一定意義。

參考文獻：

[1]翁建平. 對糖尿病流行病學、循證醫(yī)學及基礎研究的探索[J]. 中山大學學報（醫(yī)學科學版），2010，02：166-171+178.

[2]宋文春. 2型糖尿病患者血清UCP-1、ROS與胰島素抵抗和糖尿病血管并發(fā)癥的相關性研究[D].蘇州大學，2014.

[3]陳燕，黃蘇萍. ROS、SOD、GSH在糖尿病血管病變中的研究近況[J]. 江西中醫(yī)學院學報，2013，03：93-97.

[4]邢邯英，凌亦凌. 血紅素氧合酶與糖尿病[J]. 中國動脈硬化雜志，2006，10：914-916.

[5]趙麗. Nrf2/HO-1途徑對高脂飲食誘導的大鼠胰島素抵抗的保護作用和機制研究[D].第四軍醫(yī)大學，2012.

[6]王飛. 益氣養(yǎng)陰化瘀通絡中藥對糖尿病胃輕癱大鼠SOD、MDA、HO-1及Bcl-2與Bax基因表達的影響[D].河北醫(yī)科大學，2014.

[7]謝寧，吳頌，王曉博，關慧波，侯淑峰. 糖尿病動物模型研究進展[J]. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2007，06：629-632.

[8]聶小艷. 西格列汀對大劑量胰島素治療的2型糖尿病患者各項指標的影響[D].吉林大學，2014.

[9]李健. 上調(diào)血紅素氧合酶1對糖尿病心肌梗死大鼠心功能的遠期影響[D].中國人民解放軍醫(yī)學院，2012.

[10]張雨婷. HO-1與脂代謝在妊娠期糖尿病中的表達及相關性研究[D].河北醫(yī)科大學，2014.