食品中單核增生細胞李斯特氏菌快速檢測研究

劉寧 王珍惜等

【摘要】單核細胞增生李斯特氏菌在病原學上作為一種人畜共患和食源性疾病的致病菌已得到世界范圍普遍的公認。近年來，如何分離和鑒定食品中單核細胞增生李斯特氏菌已成為研究熱點。本文結(jié)合近十年的各種該病菌的快速檢測方法作了系統(tǒng)綜述，介紹了針對該病菌的快速檢測方法， 如顯色培養(yǎng)基快速檢測方法、酶聯(lián)免疫試驗檢測方法、結(jié)合單克隆抗體技術的免疫學檢測方法、反轉(zhuǎn)錄-PCR檢測方法、生物芯片，以期對食品中單核細胞增生李斯特菌的檢測起到幫助和指導作用。

【關鍵詞】單核增生細胞李斯特氏菌；檢測方法

【中圖分類號】R741.32 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）03-0234-02

基金項目： 2014年地方高校國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃資助項目（編號：201410313027）；2014年江蘇省高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃重點項目（編號：201410313027Z）；

單核細胞增生李斯特氏菌是一種短小的革蘭氏陽性無芽孢桿菌[1]，它能引起人畜的李氏菌的病，該病發(fā)病率較低，但致死率高達 20%～30%[2]，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。單核細胞增生李斯特氏菌廣泛存在于自然界中，食品中存在的單核細胞增生李斯特氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗中，必須加以重視。本文擬對單核細胞增生李斯特氏菌的檢測方法及其當前存在的問題等作系統(tǒng)介紹，以期為進一步深入研究提供參考。

1快速檢測方法

1.1 顯色培養(yǎng)基快速檢測方法

顯色或熒光鑒別培養(yǎng)基的基本原理是針對李斯特氏菌的β-D-葡萄糖苷酶和毒力因子PI-PLC酶，設計相應的底物，加入到常規(guī)選擇性培養(yǎng)基中，利用酶對底物的分解，產(chǎn)生熒光或顯色物質(zhì)，使其菌落形態(tài)或顏色不同于其他李斯特氏菌和非李斯特氏菌，從而實現(xiàn)對李斯特氏菌快速定性鑒定和菌落數(shù)目快速定量。張淑紅等[3]檢測了顯色培養(yǎng)基的特異性和靈敏度。實驗證明此種檢測方法具有較高靈敏度、特異性和選擇性，是非常有價值的分離平板。

1.2 免疫學檢測方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫試驗檢測方法（ELISA）

早期起初人們采用簡單直接的細胞計數(shù)法進行檢測，運用細胞計量術對牛奶中的單核細胞增生李斯特氏菌進行檢測。但是由于病原微生物的含量很低，僅通過細胞計數(shù)的方法檢測靈敏度無法達到。之后，基于抗原抗體的ELISA技術被廣泛應用于食品檢測中，用酶聯(lián)熒光的方法檢測食品中的單核細胞增生李斯特氏菌。ELISA的方法雖然靈敏度較細胞計數(shù)方法有很大的提高，但是由于ELISA檢測的結(jié)果容易受多種因素影響，并且容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，所以不能滿足檢測的要求。

1.2.2 結(jié)合單克隆抗體技術的免疫學檢測方法

針對和學習前人的科學成果，人們在ELISA的基礎上結(jié)合單克隆抗體技術建立了一種快速檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法[4]。建立了以高度特異的針對單核細胞增生李斯特菌和無害單增生李斯特氏菌的共同表位的單抗構(gòu)建的快速酶免疫檢測方法以及以抗單核細胞增生李斯特氏菌的特異單抗為試劑所建立的快速檢測方法[5]。國內(nèi)焦新安等制備了針對單核細胞增生李斯特菌的特異性單抗并研制了檢測該菌的ELISA檢測試劑盒，推動了單核細胞增生李斯特氏菌檢測方法的發(fā)展。

1.3 分子生物學檢測方法

1.3.1 反轉(zhuǎn)錄-PCR檢測方法

在PCR反應中，死細胞的存在使得DNA擴增數(shù)要大大降低，從而造成實驗結(jié)果的假陽性，分辨活細胞和死細胞對避免假陽性至關重要。反轉(zhuǎn)錄-PCR把mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過特異引物擴增目標cDNA進行PCR，因其具有高度敏感性，被應用于檢測具有活性的單核細胞增生李斯特氏菌。采用反轉(zhuǎn)錄-PCR的檢測結(jié)果與一般PCR的檢測結(jié)果無顯著差異，但其反轉(zhuǎn)錄-PCR卻有效地檢測到單核細胞增生李斯特氏菌活菌。李曉紅等[6]利用反轉(zhuǎn)錄-PCR方法對出口食品中單核細胞增生李斯特氏菌進行檢測，結(jié)果通過傳統(tǒng)檢測方法確證，符合率達到100%，靈敏度高。

1.4 生物芯片

生物芯片是近年來在生命科學領域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術，它主要通過微加工技術和微電子技術在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測，使樣品檢測、分析過程連續(xù)化、集成化、微型化。生物芯片能夠在短時間內(nèi)分析大量的生物分子，使人們快速準確地獲取樣品中的生物信息，它為食源性疾病快速檢測提供了良好的發(fā)展空間。王剛等正用含有小牛血清BSA（減少對其它菌的非特異性吸收）的SiO2包被的蛋白芯片對C11EG抗體（單核細胞增生李斯特氏菌一種IgG抗體）進行研究[7]。目前，應用于食品中致病菌檢測的生物芯片技術還在研究中，但我們相信建立、應用生物芯片技術將成為食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢測方法的一個發(fā)展方向。

2. 展望

單核細胞增生李斯特氏菌是WHO關注的食源性致病菌之一，也是我國食品污染物監(jiān)測網(wǎng)中檢測的重要食源性致病菌之一。隨著多學科的交叉，食源性致病菌的檢測一方面向綜合的方向發(fā)展，即集多種檢測技術于一體的多功能、全自動化大型檢測儀器不斷出現(xiàn)；另一方面，針對單個菌種和菌屬的新型培養(yǎng)基、免疫試劑盒和分子試劑盒也會不斷推向市場。無論是從哪個角度，未來檢測的方向都是向著敏感性高、特異性強、檢測時間短的檢測方法的方向發(fā)展。相信隨著對李斯特氏菌的全方位深入了解和認識，更方便快捷的檢測工具會不斷出現(xiàn)。

參考文獻

[1] 吳清平， 李善志， 張菊梅， 等. 單核細胞增生李斯特菌檢測技術研究進展[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2005， 15（7）： 888-890.

[2] 沈曉盛， 鄭國興， 李慶， 等. 食品中單核細胞增生李斯特菌的危害及其檢測[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2004， 30（8）： 87-91.

[3] 張淑紅， 吳清平， 張菊梅. 顯色培養(yǎng)基在單核細胞增生李斯特菌快速檢測中的應用研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2007， 17（1）： 43-45.

[4] 梁銳萍， 黃素珍， 胡慧強. 單核細胞增生性李斯特氏菌及其檢驗[J]. 動物科學與動物醫(yī)學， 2004， 21（11）： 47-49.

[5] 焦新安， 劉秀梵. 李斯特氏菌快速檢測研究進展[J]. 肉品衛(wèi)生， 1996， 11（1）： 28-31.

[6] 李曉紅， 蔣琴娣， 吳仲梁， 等. 利用反轉(zhuǎn)錄-PCR方法快速檢測食品中單增李斯特菌[J]. 檢驗檢疫科學， 2003， 13（6）： 20-22.

[7] 王剛， 邱陽. 單核細胞增生李斯特菌及其快速檢測[J]. 微生物學雜志， 2011， 21（1）： 52-53.