陳嘉嶼 劉德科 吳紅梅 劉熙鈺 王彪猛 馬 強 許 英

蘭州軍區(qū)總醫(yī)院消化科1(730050) 體檢中心2 甘肅省中醫(yī)學(xué)校3

高原環(huán)境特征為低壓、低氧、高寒、高輻射、氣候多變［1］，高原缺氧引起的胃腸道功能紊亂臨床上主要表現(xiàn)為腹瀉、便秘、腹痛、腹脹、消化不良、惡心嘔吐、食欲減退等癥狀，甚至可出現(xiàn)嘔血、黑便和便血，并增加原有腸道炎癥性疾病的發(fā)作風(fēng)險［2-4］，嚴重影響急進高原者的健康和生活。然而，目前對急進高原者胃腸道運動功能紊亂的發(fā)生機制仍不明確，相關(guān)干預(yù)研究較少。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是參與調(diào)節(jié)胃腸運動的重要神經(jīng)遞質(zhì)，其作用發(fā)揮系由相應(yīng)受體所介導(dǎo)，5-HT及其受體異常在胃腸道功能紊亂中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)中藥白術(shù)對胃腸運動具有雙向調(diào)節(jié)作用［5］，本研究以高原缺氧大鼠模型為研究對象，通過觀察其小腸推進率、小腸組織病理學(xué)變化和5-HT4受體表達，探討高原缺氧對大鼠小腸運動的影響及其可能機制以及生白術(shù)的干預(yù)作用。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑、儀器

清潔級 Wistar大鼠70只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心提供，許可證號:SYXK(2012-0029)。中藥生白術(shù)(市售，產(chǎn)地浙江)，馬來酸曲美布汀膠囊(0.1 g/粒，國藥準字H20040713，山西振東安特生物制藥有限公司)，5-HT4受體兔抗鼠多克隆抗體(Abcam plc.)，多聚HRP標(biāo)記抗兔IgG二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);FLYDWC50-ⅡC低壓低氧動物實驗艙(貴州風(fēng)雷氧艙有限公司)，JD-801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司)。

二、方法

1.動物分組和造模:70只Wistar大鼠隨機分為7組，分別為對照組(蘭州海拔，1430 m)、3500 m海拔模型組和相應(yīng)海拔曲美布汀、生白術(shù)干預(yù)組、5000 m海拔模型組和相應(yīng)海拔曲美布汀、生白術(shù)干預(yù)組，每組10只。各組大鼠自由飲食，6組造模大鼠置于低壓低氧艙中，急進速度0.3 m/s，直至達到設(shè)置的海拔高度，艙內(nèi)溫度22～25℃，造模時間3 d。造模過程中無大鼠死亡。

2.藥物干預(yù):曲美布汀組和生白術(shù)組分別予相應(yīng)藥物溶液1.35 g/L和540 g/L灌胃，每次2 mL，每日2次，共3 d。對照組和模型組予等體積0.9%NaCl溶液灌胃。

3.小腸推進率測定:3 d后所有大鼠予2 mL墨汁灌胃，30 min后處死，測量小腸(幽門至回盲部)長度和墨汁在小腸內(nèi)的推進距離，小腸推進率=墨汁推進距離/小腸長度×100%。

4.小腸組織病理學(xué)檢查:于距幽門2 cm處剪取長度為1 cm的小腸組織，0.9%NaCl溶液洗凈，4%中性甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，橫斷面切片，片厚4 μm，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。小腸黏膜病理變化評分標(biāo)準:①炎性細胞浸潤:無或少量(正常)，0分;單視野下≤5%(輕度)，1分;5% ～20%(中度)，2分;＞20%(重度)，3分。②腺體減少:無腺體減少(正常)，0分;減少≤1/3(輕度)，1分;1/3～2/3(中度)，2分;＞2/3(重度)，3分。③黏膜表層壞死或脫落:無或少量(正常)，0分;損傷≤1/3(輕度)，1分;1/3～2/3(中度)，2分;＞2/3(重度)，3分?？偡譃?項評分之和的均值。

5.5-HT4受體免疫組化染色:小腸組織切片脫蠟、水化，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌，加入一抗5-HT4受體兔抗鼠多克隆抗體(1∶300)，37 ℃溫箱孵育90 min，PBS洗滌，依次加入試劑1和試劑2，37℃溫箱各孵育20 min，PBS洗滌，加入DAB顯色液，37℃溫箱孵育5 min，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。5-HT4受體陽性細胞呈棕色，分布于黏膜層和肌層。每張切片隨機選取5個10×40倍視野，以形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計算5-HT4受體免疫陽性面積，結(jié)果取均值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、小腸推進率

模擬海拔3500 m時，模型組大鼠小腸推進率明顯減緩，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);曲美布汀組和生白術(shù)組小腸推進率較模型組有所加快，但僅生白術(shù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與對照組相比無明顯差異(P ＞0.05)(表1)。

模擬海拔5000 m時，模型組大鼠小腸推進率明顯加快，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);曲美布汀組和生白術(shù)組小腸推進率較模型組有所減緩，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中曲美布汀組與對照組相比仍有顯著差異(P＜0.05)，生白術(shù)組與對照組相比則無明顯差異(P＞0.05)(表1)。

表1 各組大鼠小腸推進率比較(，%)

表1 各組大鼠小腸推進率比較(，%)

＊與對照組比較，P＜0.05;▲與同海拔模型組比較，P＜0.05;△與同海拔曲美布汀組比較，P＜0.05

二、小腸組織5-HT4受體表達

模擬海拔3500 m時，模型組大鼠小腸組織5-HT4受體免疫陽性面積明顯減少，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);曲美布汀組和生白術(shù)組5-HT4受體免疫陽性面積較模型組有所增加，但僅生白術(shù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與對照組相比無明顯差異(P＞0.05)(表2、圖1)。

模擬海拔5000 m時，模型組大鼠5-HT4受體免疫陽性面積明顯增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);曲美布汀組和生白術(shù)組5-HT4受體免疫陽性面積較模型組有所減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與對照組相比則均無明顯差異(P ＞0.05)(表2、圖1)。

表2 各組大鼠小腸組織5-HT4受體免疫陽性面積比較()

表2 各組大鼠小腸組織5-HT4受體免疫陽性面積比較()

＊與對照組比較，P＜0.05;▲與同海拔模型組比較，P＜0.05;△與同海拔曲美布汀組比較，P＜0.05

三、小腸組織病理學(xué)變化

模擬海拔3500 m時，模型組大鼠小腸黏膜中度損傷，病理評分與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);曲美布汀組和生白術(shù)組小腸黏膜損傷較模型組有所減輕，但僅生白術(shù)組病理評分與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與對照組相比無明顯差異(P＞0.05)(表3、圖2)。

模擬海拔5000 m時，模型組大鼠小腸黏膜重度損傷，病理評分與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);曲美布汀組和生白術(shù)組小腸黏膜損傷較模型組有所減輕，兩組病理評分與模型組和對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，生白術(shù)組與曲美布汀組間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P均 ＜0.05)(表3、圖2)。

圖1 各組大鼠小腸組織5-HT4受體免疫組化染色(×400)

圖2 各組大鼠小腸組織病理學(xué)變化(HE染色，×200)

表3 各組小腸黏膜損傷病理評分比較()

表3 各組小腸黏膜損傷病理評分比較()

＊與對照組比較，P＜0.05;▲與同海拔模型組比較，P＜0.05;△與同海拔曲美布汀組比較，P＜0.05

討 論

高原環(huán)境氣候惡劣，可引起神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，胃腸激素和神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常，進而影響胃腸道運動功能。急進高原缺氧引起的胃腸道運動功能紊亂又稱胃腸型高原反應(yīng)，發(fā)病率較高，患者胃腸道運功功能的改變因海拔高度不同而異，臨床表現(xiàn)多樣，海拔3500 m時，腸道運動呈抑制狀態(tài)，蠕動緩慢;海拔高達5000 m時，腸道運動功能紊亂，蠕動加快。上述變化的發(fā)生機制可能與機體反應(yīng)能力有關(guān)，3000 m海拔為機體反應(yīng)的臨界高度，隨著海拔的增高，空氣含氧量逐漸降低，機體通過神經(jīng)體液調(diào)節(jié)以滿足重要臟器的血氧供應(yīng)，導(dǎo)致腸道血氧供給減少，腸蠕動減慢;海拔高達5000 m時，空氣含氧量進一步降低，機體無法完成自我調(diào)節(jié)以滿足組織細胞的基本需求，導(dǎo)致各組織器官功能紊亂，腸蠕動加快。本實驗中模型組大鼠在模擬海拔3500 m時表現(xiàn)為小腸推進率減緩，在模擬海拔5000 m時表現(xiàn)為小腸推進率加快，與上述理論相符，證實高原缺氧引起的小腸運動功能紊亂與海拔高度密切相關(guān)。

5-HT主要由胃腸道黏膜層的腸嗜鉻細胞合成、分泌，參與胃腸道運動、分泌和感覺功能的調(diào)節(jié)以及腦-腸軸的調(diào)控，研究顯示5-HT可通過5-HT4受體調(diào)節(jié)腸道蠕動反射和平滑肌張力，從而發(fā)揮促動力作用［6-9］。5-HT4受體廣泛分布于人類胃腸道黏膜層、黏膜下層和肌層，神經(jīng)細胞、平滑肌細胞、上皮細胞中均可檢測到5-HT4mRNA表達［9］。5-HT激動腸肌叢神經(jīng)節(jié)細胞上的5-HT4受體可引起平滑肌收縮，張力增加，使腸蠕動加快;激動平滑肌細胞上的5-HT4受體則可導(dǎo)致平滑肌舒張;腸上皮細胞中的5-HT4受體則主要參與腸道分泌功能的調(diào)節(jié)［10-12］。本實驗結(jié)果顯示，在模擬的高海拔缺氧環(huán)境中，模型組大鼠小腸黏膜損傷明顯，黏膜表層中至重度壞死脫落，腺體減少，炎性細胞浸潤，海拔越高，黏膜損傷越重;小腸組織中5-HT4受體的變化與小腸運動功能的變化相一致，3500 m較高海拔時，5-HT4受體數(shù)量減少，小腸推進率減緩，5000 m高海拔時，5-HT4受體數(shù)量增加，小腸推進率加快。推測小腸運動功能紊亂與小腸組織缺氧損傷，使5-HT4受體表達分布異常有關(guān)。

根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，高海拔環(huán)境下機體缺氧可致脾胃氣虛無力，運化功能失常。中藥白術(shù)為菊科植物白術(shù)的干燥根莖，性溫，味甘、苦，歸脾、胃經(jīng)，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之功效，可用于脾虛食少、腹脹泄瀉等癥的治療。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)對胃腸道平滑肌具有興奮和抑制的雙向調(diào)節(jié)作用［5］，既可治療脾虛泄瀉，又可治療氣虛便秘。張印等［13］發(fā)現(xiàn)大劑量生白術(shù)能明顯促進小鼠小腸推進功能;趙文龍等［14］發(fā)現(xiàn)生白術(shù)能升高脾虛模型大鼠的血清胃泌素和生長抑素水平，緩解脾虛癥表現(xiàn)出的便溏、納呆、少動等表征;吳翰桂等［15］的研究顯示白術(shù)可增強小鼠小腸平滑肌收縮幅度和頻率，并改善其抗缺氧能力，對胃腸道運動有明顯促進作用。由此推測生白術(shù)可能對缺氧所致脾胃氣虛引發(fā)的胃腸道癥狀有一定改善作用。本實驗以生白術(shù)干預(yù)高原缺氧模型大鼠，結(jié)果顯示其對模型大鼠3500 m較高海拔時的腸蠕動減緩和5000 m高海拔時的腸蠕動加快均有明顯改善作用，效果優(yōu)于陽性對照藥物馬來酸曲美布汀，同時小腸組織5-HT4受體數(shù)量發(fā)生相應(yīng)變化，小腸黏膜損傷明顯減輕，提示生白術(shù)可能通過調(diào)節(jié)5-HT4受體有效改善高海拔缺氧環(huán)境下的小腸運動功能紊亂，對小腸黏膜損傷亦有一定修復(fù)作用。

綜上所述，急進高原缺氧引起的胃腸道運動功能紊亂與海拔高度關(guān)系密切，臨床表現(xiàn)各異，不論是預(yù)防還是治療都應(yīng)區(qū)別對待。生白術(shù)作為治療胃腸道疾病的常用中藥，可能通過提高機體免疫、調(diào)節(jié)胃腸激素和神經(jīng)遞質(zhì)等多個途徑實現(xiàn)對胃腸道功能的調(diào)控。本研究結(jié)果為生白術(shù)用于胃腸型高原反應(yīng)的防治提供了實驗依據(jù)，其對5-HT4受體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的確切機制有待進一步研究。

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