李 莉，田士林

(黃淮學(xué)院生物工程系，河南 駐馬店643000)

辣椒不僅是一種重要的蔬菜作物，還是天然食品色素的主要來(lái)源。成熟的辣椒果實(shí)常見(jiàn)的有紅、黃、橙等顏色，其中紅色辣椒果實(shí)是食品色素的主要來(lái)源。辣椒紅素(3，3′-dihydroxy-β，k-Caroten-6′-one)是辣椒果實(shí)紅色的主要成分，是一種兼具安全、營(yíng)養(yǎng)和保健作用的天然食用色素，分子式為C40H56O3［1］。它主要存在于辣椒(Capsicum annuum L.)果皮色素母細(xì)胞中的類(lèi)囊體膜上，占總類(lèi)胡蘿卜素含量的60%以上［2］。Lcyb是調(diào)控β-胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶基因，其表達(dá)強(qiáng)弱直接會(huì)影響 β-胡蘿卜素的合成［3，4］，但Lcyb缺失或突變能否影響果實(shí)中辣椒紅素含量的變化未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為此，本文通過(guò)Lcyb沉默，探討Lcyb對(duì)辣椒果實(shí)中辣椒紅素含量的影響，旨在為辣椒紅素合成調(diào)控機(jī)理的解析提供新信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

辣椒R15(Capsicum annuum cv.R15)由西北農(nóng)林科技大學(xué)辣椒課題組惠贈(zèng)。

1.2 載體構(gòu)建

煙草脆裂病毒(TRV)被作為基因沉默載體，根據(jù)TRV結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)含有上游BamHI酶切位點(diǎn)(F:5’-CGCGGATCCCATTGCCCTTTAATCATTTATT-3’)和下游含有Kpn I位點(diǎn)(R:5’-CGGGGTACCTTCACAGAGCTAAAGGCACTAAC-3’)的引物，隨后被轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化到TRV載體中。在本次實(shí)驗(yàn)中，cv.R15材料綠熟期的果實(shí)被用來(lái)作為病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)實(shí)驗(yàn)材料。以下是煙草脆裂病毒的結(jié)構(gòu)示意圖以及載體構(gòu)建示意圖(圖1)。

圖1 載體構(gòu)建結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Construction of TRV expression vector

LB:T-DNA左邊界;RB:T-DNA右邊界;2×35S:35S啟動(dòng)子;CP:外殼蛋白;RdRp:RNA依賴(lài)性RNA聚合酶;MP:移動(dòng)蛋白;16K:16 KDa蛋白;R:核酶;N:NOS終止子;MCS:多克隆位點(diǎn);pTRV2/Lcyb為L(zhǎng)cyb基因和TRV2連接形成的重組載體。

采用Trizol方法提取果實(shí)總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA被作為模板為PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離，DNA凝膠試劑盒回收目的片段，之后回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶16℃過(guò)夜連接到克隆載體pMD19-T上，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中。經(jīng)測(cè)序檢驗(yàn)證明無(wú)移碼突變或堿基缺失，然后把目標(biāo)片段從PMD19-T載體上用酶BamHI和KpnI切下來(lái)，同時(shí)將質(zhì)粒pTRV2用同樣的內(nèi)切酶切下來(lái)。然后將目的片段和pTRV2連接起來(lái)，沉默載體構(gòu)建成功。最后把pTRV1和pTRV2載體通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101［5］，液氮保存以備后續(xù)使用。

1.3 病毒注射

將含有pTRV1、pTRV2及pTRV2/Lcyb菌液分別搖至OD600=1.0。將農(nóng)桿菌(GV3101)菌液pTRV1分別與農(nóng)桿菌(GV3101)菌液pTRV2及農(nóng)桿菌(GV3101)菌液pTRV2/Lcyb的按照1∶1(V/V)混合。在注射前，首先選擇果齡、大小、健康狀況一致的辣椒綠熟期(花后25 d)果實(shí)作為處理和對(duì)照材料。然后用注射器針頭在辣椒果柄基部扎一個(gè)孔，孔的深度為果柄直徑的1/2，然后將含有pTRV1、pTRV2(空載體，用TRV/00表示)的菌液及含有pTRV1、pTRV2/Lcyb(攜帶目的基因的載體，用TRV/Lcyb表示)的菌液用去掉針頭的注射器分別注射到綠熟期辣椒果實(shí)的果柄中。然后將辣椒連盆放入人工氣候室中(溫度18℃，相對(duì)濕度35%)暗培養(yǎng)兩天，然后將人工氣候箱調(diào)為(23℃，16 h光照)/(20℃，8 h黑暗)的光周期，相對(duì)濕度為35%的環(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)，15天后，對(duì)照組(TRV/00)和沉默組果實(shí)(TRV/Lcyb)分別采摘用于后續(xù)基因表達(dá)和辣椒紅素含量的分析。

1.4 基因表達(dá)的檢測(cè)

采用Trizol法分別從對(duì)照和沉默組提取辣椒果實(shí)的總RNA［6］。用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKa-Ra，寶生生物公司，中國(guó))合成第一鏈cDNA，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)?；虮磉_(dá)水平的高低采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，用SYBR作為熒光染料，染料購(gòu)自TaKaRa中國(guó)大連寶生生物公司。實(shí)時(shí)定量PCR采用20μl反應(yīng)體系，包括10.0μl SYBR Premix Ex Taq II，2.0μl cDNA模板，上下游引物各:6.4μl ddH2O 0.8μl。PCR擴(kuò)增循環(huán)體系為95℃，1 min;95℃，10 s;48℃，30 s;72℃，20 s;總共45循環(huán)。Ubi3(AY486137.1)被作為內(nèi)參基因［7］，正向引物序列F:5’-CATTGCCCTTTAATCATTTATT-3’，反向引物序列R:5’-TTCACAGAGCTAAAGGCACTAAC-3’?；蛳鄬?duì)表達(dá)水平的計(jì)算參考Livak等的方法［8］。所有樣品一式三份，每個(gè)處理三次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 辣椒紅素含量的測(cè)定

辣椒紅素含量的測(cè)定采用Tian等(2014)的方法［5］。辣椒紅素的抽提具體如下:取5.0 g辣椒果皮組織，加入5 ml丙酮(0.1%BHT)于研缽中，將研缽置于冰上在暗中研磨成糊漿，將研磨后的辣椒組織倒入50 ml的具塞離心管中在3 500 rpm離心10分鐘，然后將抽提物轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，樣品再用5.0 ml丙酮重復(fù)抽提2次，直至殘?jiān)鼮榘咨珵橹?。合并抽提液于一個(gè)新的離心管中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥器中常溫暗光離心蒸干，然后密封管口，用錫箔紙裹包嚴(yán)實(shí)后存放于20℃冰箱中以備HPLC檢測(cè)用。HPLC分析方法參照Tian等(2014)的方法［5］。液相色譜上樣體積為20μL，采用C-18柱(5μm，150 mm×4.6 mm)進(jìn)行色素分離分析。流動(dòng)相A(乙腈∶2-丙醇∶水/39∶53∶8)，流動(dòng)相B(乙腈∶2-丙醇/60∶40);梯度洗脫:B相0-30 min從0 to 100%;流速設(shè)定為0.3 mL/min，柱溫為40℃。辣椒紅素標(biāo)準(zhǔn)品(0.001-0.1 mg/mL)在454 nm作校準(zhǔn)樣。根據(jù)標(biāo)樣的出峰時(shí)間確定樣品中的辣椒紅素成分及含量。辣椒紅素標(biāo)樣購(gòu)自Extrasynthèse公司(Genay，法國(guó))。所有的樣品均在暗光下冰上操作。標(biāo)樣和樣品用甲醇∶乙腈(1∶1，V/V)稀釋?zhuān)?］。每組樣品測(cè)定三個(gè)重復(fù)。取三次測(cè)定的平均值作為該時(shí)刻該處理的辣椒紅素含量。采用SAS(SAS Institute，version 8.2)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，采用SigmaPlot10.0軟件對(duì)辣椒紅素含量變化和基因表達(dá)情況進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 VIGS沉默對(duì)Lcyb表達(dá)的影響

由以上分析得知，沉默Lcyb基因后，辣椒果色的形成受到了影響，導(dǎo)致無(wú)論從表型上還是從儀器分析上均說(shuō)明果實(shí)顏色的形成受到了抑制。為了進(jìn)一步證明VIGS沉默效果，我們對(duì)沉默后果實(shí)中Lcyb基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析(圖2)，從圖2可以明顯地看出，經(jīng)過(guò)沉默的辣椒果實(shí)Lcyb基因表達(dá)量明顯低于對(duì)照。這說(shuō)明采用TRV病毒的確能夠起到沉默Lcyb基因的效果，沉默效率約為80%。

圖2 沉默后基因表達(dá)量變化比較Fig.2 The change of Lcyb gene expression level by VIGS

(A)為實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定的基因表達(dá)量，TRV/00為空載體，TRV/Lcyb為沉默載體;(B)為半定量PCR分析。

2.2 Lcyb沉默后果實(shí)表型變化

沉默結(jié)果(圖3)表明，在辣椒果實(shí)綠熟期(花后25天)，果實(shí)顏色為綠色。此時(shí)我們對(duì)果實(shí)進(jìn)行處理，其中TRV/00為只注射TRV病毒載體的對(duì)照果實(shí)，TRV/Lcyb為攜帶有Lcyb基因的重組TRV病毒載體。15天后，果色發(fā)生了明顯的變化，只注射空載體的果實(shí)顏色正常轉(zhuǎn)紅，這說(shuō)明注射煙草脆裂病毒TRV不影響辣椒果實(shí)的正常轉(zhuǎn)紅。而注射攜帶有目的基因(TRV/Lcyb)的果實(shí)顏色出現(xiàn)了不均勻的橙紅色，果實(shí)顏色不能正常轉(zhuǎn)紅，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沉默Lcyb基因時(shí)首先影響的是果實(shí)顏色的變化。

圖3 基因沉默前后辣椒果色變化情況比較Fig.3 Phenotype changes in pepper fruits with Lcyb gene silencing via VIGS

2.3 VIGS沉默對(duì)辣椒果實(shí)顏色的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證沉默后果實(shí)顏色的變化，我們對(duì)果實(shí)的顏色差異進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中我們可以看出，以TRV/00為對(duì)照，比較沉默組(TRV/Lcyb)果實(shí)顏色差異發(fā)現(xiàn)，無(wú)論△L、△a、△b和△E，相對(duì)于對(duì)照組顏色均有很大的差異。這進(jìn)一步說(shuō)明沉默Lcyb基因的確造成了辣椒果實(shí)顏色的變化。

表1 Lcyb基因沉默后果實(shí)色差比較Tab.1 The color variation in TRV/00 and TRV/Lcyb fruits between the phenotypes

TRV/00:注射空載體的辣椒果實(shí)，作為對(duì)照;TRV/Lcyb:注射攜帶Lcyb基因的煙草脆裂病毒載體(TRV);在計(jì)算△L，△a和 △b時(shí)，TRV/00的色度作為對(duì)照;每個(gè)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)。

2.4 VIGS 沉默對(duì)辣椒紅素含量的影響

2.4.1 HPLC測(cè)定辣椒紅素出峰時(shí)間圖 通過(guò)高效液相色譜技術(shù)，我們對(duì)辣椒果實(shí)中辣椒紅素含量進(jìn)行了測(cè)定［4，5］，辣椒紅素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自法國(guó)Extrasynthèse公司，從圖4A中可以看出，辣椒紅素標(biāo)樣純度較高，出峰時(shí)間集中在7.36 min，峰圖犀利，可以作為測(cè)定辣椒紅素含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品。B圖為樣品，從圖4B中可以看出，在7.36 min有一個(gè)較大的峰，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)樣品峰圖比較，這個(gè)峰應(yīng)該是辣椒紅素成分峰。因此HPLC在454nm可以測(cè)定辣椒紅素含量的變化。

圖4 HPLC檢測(cè)辣椒果皮中辣椒紅素含量Fig.4 Resolution of Capsicum pericarp capsanthin by HPLC

圖5 沉默后辣椒紅素含量變化Fig.5 Capsanthin content in pepper fruits with Lcyb gene silencing via VIGSpsanthin by HPLC

2.4.2 辣椒紅素含量比較 通過(guò)分析可以看出(圖5)，通過(guò)病毒誘導(dǎo)基因沉默，沉默組辣椒紅素含量明顯低于對(duì)照，這說(shuō)明，通過(guò)沉默Lcyb基因?qū)е吕苯芳t素含量發(fā)生了變化，直接導(dǎo)致辣椒紅素含量的降低。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)沉默Lcyb基因，辣椒果實(shí)顏色明顯變淺(表1)，與正常果實(shí)相比，辣椒紅素含量下降比較明顯。說(shuō)明辣椒紅素的合成不但與Ccs基因有關(guān)，而且也與調(diào)控β-胡蘿卜素合成的Lcyb基因有關(guān)。沉默Lcyb基因間接地影響了辣椒紅素的正常合成。Ccs基因的缺失或突變能夠影響辣椒紅素含量的變化［9］，而Lcyb基因的非正常表達(dá)也同樣能夠?qū)е吕苯芳t素含量的降低，影響成熟期辣椒果實(shí)顏色的形成。

辣椒果實(shí)紅色的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，它涉及到很多基因的參與［5］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)病毒誘導(dǎo)基因?qū)苯饭麑?shí)中調(diào)控β-胡蘿卜素合成的基因進(jìn)行沉默，研究該基因沉默后對(duì)辣椒紅素合成的影響。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)沉默Lcyb基因，辣椒紅素含量發(fā)生了大幅度的降低。這說(shuō)明，Lcyb基因?qū)苯芳t素合成有一定的調(diào)控關(guān)系，結(jié)果的獲得豐富了辣椒紅素調(diào)控的分子機(jī)理。

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