陳 婧，桑維鈞

(貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽550025)

玄參(Scrophularia ningpoensis Hemsl.)是著名的傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)疏》［1］。又稱元參、黑參、浙玄參，屬玄參科(Scrophulariaceae)多年生深根性草本藥用植物，以其干燥塊根入藥，味甘、苦、咸，性微寒，具有涼血滋陰、瀉火解毒的功效［2］。道真縣是貴州省玄參主要產(chǎn)區(qū)，常年種植面積達(dá)幾百公頃，生產(chǎn)的玄參以其有效成分含量高、質(zhì)量好、加工考究獨(dú)特而行銷國內(nèi)外。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，道真玄參種植基地常有玄參黑斑病發(fā)生，對道真玄參的產(chǎn)量及品質(zhì)均造成一定程度的影響。目前國內(nèi)外玄參研究多集中在其藥理作用，鮮見病害防治報(bào)道。為了準(zhǔn)確鑒定引起該病害的病原菌，在病原菌形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)鑒定同時(shí)篩選了幾種殺菌劑對玄參黑斑病菌絲生長影響的實(shí)驗(yàn)，旨在為生產(chǎn)中玄參黑斑病無公害防治技術(shù)提供。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源:菌株分離自貴州省道真縣陽溪鎮(zhèn)玄參種植基地采集的受害玄參標(biāo)本。

標(biāo)本采集時(shí)間2013年7月-2014年8月。

供試培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 ml。

供試試劑:真菌DNA基因組提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，通用引物ITS1和ITS4、2×Taq PCR MasterMix(生工生物工程(上海)股份有限公司)

供試藥劑:8%寧南霉素水劑(華潤(上海)生物科技有限公司)，50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑(鄭州鄭氏化工產(chǎn)品有限公司)，18.7%丙環(huán)·嘧菌酯乳懸劑(瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司)，30%王菌銅微乳劑(西安近代農(nóng)藥科技有限公司)，0.3%丁子香酚可溶液劑(保定市亞達(dá)化工有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 病原物的分離培養(yǎng) 采用組織分離法。在感病變色處切取病健交界約5 mm的組織，用70%的乙醇消毒5 s，再用0.1%HgCl消毒2-4 min，移至滅菌水漂洗3次以上，將該組織接至PDA平板培養(yǎng)基上，每皿3個(gè)，均勻放置。再挑取邊界處病原菌進(jìn)行純化，重復(fù)3次，以此獲得純培養(yǎng)菌株。

1.2.2 病原菌的培養(yǎng)性狀觀察 觀察病原菌菌落的形態(tài)菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢細(xì)胞、分生孢子的形態(tài)特征。

1.2.3 病原菌的rDNA－ITS擴(kuò)增及序列分析

病原菌DNA的提取:使用真菌DNA基因組提取試劑盒提取該病原菌的基因組DNA，操作方法具體見試劑盒內(nèi)說明書。

rDNA-ITS擴(kuò)增:采用通用引物ITS1、ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物、反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件如下:

RCR產(chǎn)物的檢測與純化:吸取5μLRCR產(chǎn)物，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，該擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)分離后，在紫外燈的照射下切取目的條帶，采用DNA片段快速膠回收試劑盒進(jìn)行回收、純化。

rDNA-ITS測序及分析:純化的PCR產(chǎn)物，送由北京諾賽基因組研究中心有限公司測序(單向測序)。將獲得的ITS序列提交到美國NCBI的GenBank數(shù) 據(jù) 庫(http://www.ncbi.nlm.nih/blast)，用Blast工具與已登記序列進(jìn)行比對分析。所得rDNA-ITS序列同源性分析結(jié)果與病原菌形態(tài)學(xué)特征結(jié)合，最終確定道真玄參黑斑病病原菌歸屬。

1.2.4 殺菌劑篩選 采用生長速率測定法。每種藥劑5個(gè)濃度梯度，吸取1ml供試藥劑到冷卻至50oC左右的9mLPDA培養(yǎng)皿中，制成含藥平板培養(yǎng)基，設(shè)無菌水為對照，每個(gè)處理3次重復(fù)，待完全冷卻后接入黑斑病菌菌絲塊(直徑5mm圓片)，培養(yǎng)皿直徑為9cm。病原菌在28oC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后，用十字交叉法檢查各處理病原菌生長情況，分別測量菌落的直徑，計(jì)算各殺菌劑對病菌的相對抑制率。

抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100

采用農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所﹑武漢市蔬菜科學(xué)研究所聯(lián)合開發(fā)的農(nóng)藥室內(nèi)生物測定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。該處理系統(tǒng)中，縱坐標(biāo)(y)由抑制率轉(zhuǎn)化成的抑制機(jī)率值表示，橫坐標(biāo)(x)由藥劑濃度轉(zhuǎn)換的對數(shù)值表示，根據(jù)機(jī)率值與對數(shù)值兩者之間的線性回歸關(guān)系，求得各藥劑的毒力回歸方程、抑制中濃度EC50及相關(guān)系數(shù)［3］。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的培養(yǎng)性狀及形態(tài)觀察

病原菌在28oC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～8 d，菌落圓形或近圓形，在PDA平板上鋪展，呈致密的毛氈狀，菌落有明顯的兩層輪紋，邊緣整齊。初期灰白色，逐漸轉(zhuǎn)為墨綠色或黑色。根據(jù)顯微鏡下觀察病原菌菌落、菌絲、分生孢子等的形態(tài)進(jìn)行初步鑒定，基本確定其符合鏈格孢菌(Alternaria sp.)形態(tài)特征［4］。

2.2 病原菌rDNA－ITS序列分析

病原菌基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到576個(gè)堿基，將病原菌rDNA-ITS序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，結(jié)果顯示，與Alternaria alternata(GenBank accession:KM519671.1)的ITS序列的最高(Blast的比對為100%)。

圖1 病原菌形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Pathogen Morphologic Character

根據(jù)病原菌形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析比對結(jié)果，確認(rèn)道真玄參黑斑病的病原為鏈格孢菌Alternaria alternata.。

表1 殺菌劑對病菌的抑制效果Tab.1 Toxic activity of fungicides against on pathogen

2.3 室內(nèi)毒力測定

室內(nèi)殺菌劑毒力測定結(jié)果(表1)表明，5種供試殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用均與藥劑濃度呈正相關(guān)，其中丙環(huán)·嘧菌酯，丁子香酚，咪鮮胺錳鹽對病菌有明顯的抑制作用。

3 小結(jié)與討論

鏈格孢菌是一種常見的植物病原真菌，在自然界的土壤、植物上分布廣泛。鏈格孢菌屬于真菌界，半知菌綱，鏈孢霉目，黑霉科，鏈格孢屬。其形態(tài)易受環(huán)境的影響而變異，故種類繁多。目前，該屬的分類鑒定主要依據(jù)其形態(tài)學(xué)特征，但一些學(xué)者認(rèn)為這有一定的局限性，會出現(xiàn)一些不精確的現(xiàn)象［5］。本研究基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定，同時(shí)利用分子生物學(xué)方法對貴州省道真玄參黑斑病病原菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行分析和比對，進(jìn)一步精確鑒定引起道真玄參黑斑病的病原菌為鏈格孢菌。試驗(yàn)表明，丙環(huán)·嘧菌酯，咪鮮胺錳鹽，丁子香酚，王菌銅對道真玄參黑斑病菌均有明顯的抑菌效果。其中，抑制效果最好的為丁子香酚。丁子香酚作為一種新型植物源殺菌劑，具有高效、廣譜、毒性低等特點(diǎn)，本試驗(yàn)為中藥種植中無公害防治研究提供了一定的理論依據(jù)。

［1］繆希雍(明).神農(nóng)本草經(jīng)疏［M］.太原:山西科學(xué)技術(shù)出版社，2013.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

［3］陶挺燕，何 凡，范鴻雁，等.幾種殺菌劑對荔枝霜疫霉病的室內(nèi)毒力測定［J］.農(nóng)藥，2010，49(1):72-73.

［4］陸家云.植物病原真菌學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

［5］朱桂寧，蔡健和，胡春錦，等.廣西山藥炭疽病病原菌的鑒定與ITS序列分析［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2007，37(6):572-577.