王文文，張東峰，湯敬謙

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東廣州510300；2.廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東廣州510300；3.暨南大學(xué)圖書館，廣東廣州510632）

黃皮果汁中酯酶產(chǎn)生細(xì)菌的選育與酶學(xué)特性研究

王文文1，2，張東峰1，2，湯敬謙3

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東廣州510300；2.廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東廣州510300；3.暨南大學(xué)圖書館，廣東廣州510632）

為獲得優(yōu)良酯酶產(chǎn)生菌，從自然發(fā)酵的黃皮果汁中進(jìn)行篩選。通過對(duì)樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)和平板初篩，從黃皮果汁中篩選出酯酶產(chǎn)生菌106株，然后再采用三乙酸甘油酯為唯一碳源進(jìn)行馴化，搖瓶發(fā)酵等進(jìn)一步進(jìn)行篩選，通過測(cè)定酶活，最后獲得1株優(yōu)良酯酶產(chǎn)生菌C10。經(jīng)形態(tài)特征、生理生化以及16S rDNA序列分析，斷定該菌為蠟狀芽孢桿菌屬（Bacillus cereus.）。對(duì)菌株C10所產(chǎn)酯酶的部分酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：該菌株所產(chǎn)的酯酶為堿性酯酶，最適作用pH為9.0，最適作用溫度為60℃，且該酯酶具有較好的耐熱性和堿穩(wěn)定性。

蠟狀芽孢桿菌；酯酶；酶學(xué)特性

酯酶（Esterase，EC3.1.1.1）是指能夠催化羧酸酯的酶的總稱，水解時(shí)催化酯鍵產(chǎn)生甘油和脂肪酸；合成時(shí)，把酸的羧基與醇的羥基脫水縮合，產(chǎn)物為酯類及其他香味物質(zhì)，它廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)［1］。國內(nèi)外的研究多集中在動(dòng)植物酯酶上，而對(duì)微生物酯酶報(bào)道較少。而微生物酯酶與動(dòng)物脂肪酶相比，具有更廣的作用pH、作用溫度范圍，高穩(wěn)定性和活性，底物特異性和立體選擇性［2］。微生物資源豐富，微生物酯酶已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、污水處理和生物修復(fù)等領(lǐng)域，微生物酯酶已成為研究熱點(diǎn)［3-8］。本文以三乙酸甘油酯為底物，從自然發(fā)酵的黃皮果汁中篩選產(chǎn)酯酶優(yōu)良的菌株，并從最適溫度、最適pH、熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性等方面研究酯酶的酶學(xué)特性。

1材料與方法

1.1材料與儀器

自然發(fā)酵的黃皮果汁。溴甲酚紫及三乙酸甘油酯等購自啟隆生物科技有限公司，所有試劑均為分析純?；A(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏20.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，（NH4）2SO45.0 g/L，K2HPO45.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，NaCl 0.5 g/L，調(diào)pH至7.0，121℃滅菌20 min后加入三乙酸甘油酯10.0 mL/L（三乙酸甘油酯需乳化6 min，乳化劑為吐溫）；選擇性平板培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加三乙酸甘油酯乳化液25.0 mL/L，瓊脂20.0 g/L，溴甲酚紫0.04 g/L，pH 7.2，121℃，滅菌20 min；搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基：在選擇性平板培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上去掉瓊脂和溴甲酚紫，并且以三乙酸甘油酯為唯一碳源；產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基同基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

QYC-200全溫度恒溫培養(yǎng)搖床：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；A200基因擴(kuò)增儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；RDY-SP1Z核酸電泳儀：北京榮陽經(jīng)典科技有限公司；GI-1凝膠成像系統(tǒng)：通寶達(dá)成科技（北京）有限公司；KDC-210HR高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C雷磁酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠；S22PC分光光度計(jì)：上海凌光技術(shù)有限公司。

1.2酯酶產(chǎn)生菌的分離純化

取自然發(fā)酵的黃皮果汁樣品3 mL加入到含有100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的錐形瓶中進(jìn)行富集培養(yǎng)，30℃恒溫200 r/min培養(yǎng)36 h后，吸取10 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于含有90 mL新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基的錐形瓶中，仍在上述條件下富集培養(yǎng)。將富集培養(yǎng)的培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，分別取一定量涂布在選擇性平板培養(yǎng)基礎(chǔ)上，30℃培養(yǎng)24 h，直至出現(xiàn)透明圈，用竹簽挑取透明圈比較明顯的單菌落劃線分離純化。依據(jù)透明圈直徑與菌落直徑比值的大小分離出優(yōu)良酯酶產(chǎn)生菌。

1.3產(chǎn)酶發(fā)酵復(fù)篩

挑取酯酶產(chǎn)生菌單菌落接種于裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的錐形瓶中，進(jìn)行種子活化，待菌體長至對(duì)數(shù)生長期，離心收集菌體并接入產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃，200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h，然后測(cè)定酯酶活力，根據(jù)酯酶活力篩選優(yōu)良菌株。

1.4測(cè)定酯酶活力［9］

將培養(yǎng)好的發(fā)酵液于4℃，4000r/min離心15min，收集上清液，即得粗酶液。吐溫與三乙酸甘油酯體積比2.5∶1混合，充分乳化，取5 mL乳化液，加pH7.0的磷酸緩沖液4 mL，室溫保溫6 min，然后加1 mL粗酶液，開始計(jì)時(shí)，繼續(xù)保溫10 min～30 min后，加20 mL 95%的無水乙醇終止反應(yīng)。用滅活酶液作對(duì)照。作用后的酶液與對(duì)照組分別用0.05 mol/L的NaOH進(jìn)行滴定，酚酞作指示劑，根據(jù)兩者的堿液消耗差值計(jì)算酶活。酶活力單位定義為：在本實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘釋放出1 μmol游離醋酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.5菌株鑒定

參照《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化鑒定［10］，并進(jìn)行16S rDNA基因序列分析。利用CTAB法（十六烷基三甲基溴化銨法）對(duì)菌株總DNA（脫氧核糖核苷酸）進(jìn)行提取，細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行序列擴(kuò)增。上游引物序列為：5’-AGAGATTGATCCTGGCTCTG-3’；下游引物序列為：5’-GGTTTCCTTGTTACGACAT-3’。擴(kuò)增反應(yīng)體系如下（50 μL）：dNTP（10 mmol/L）1 μL，Mg2+（25 mmol/L）4 μL，forward primer（上游引物）（50 μM）0.5 μL，reverse primer（下游引物）（50 μmol/L）0.5 μL，模板DNA 1 μL，TaKaRa primer STAR HS高保真酶0.5 μL（5 unit/μL），10×buffer 5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。

擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性20 s，55℃退火10s，72℃延伸1.5min，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，保溫5 min。使用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收16S rDNA的基因片段，將純化后的PCR產(chǎn)物送至華大基因有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI的Genbank中進(jìn)行相似性分析，并用Mega5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6酯酶酶學(xué)特性研究

酯酶的酶活力受外界條件的影響較大，本研究擬從酯酶反應(yīng)的最適pH、最適溫度、酯酶的pH穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性等方面對(duì)酯酶的酶學(xué)特性進(jìn)行初步探討。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)酶發(fā)酵篩選結(jié)果

圖1　10株菌的產(chǎn)酯酶活力Fig.1Esterase activity of 10 strains

從選擇性平板培養(yǎng)基上挑選到106株產(chǎn)透明圈的菌株，經(jīng)搖瓶發(fā)酵篩選，最終確定10株相對(duì)產(chǎn)酯酶較好的菌株，如圖1所示。10株菌的產(chǎn)酶活力分布在7.88 U/mL～24.90 U/mL之間，其中C2，C4，C10三株菌產(chǎn)酯酶活力超過20 U/mL，C10產(chǎn)酯酶活力最高，達(dá)到24.90 U/mL，因此，選取該菌株進(jìn)行深入研究。

2.2C10菌株的鑒定

菌株C10的菌落形態(tài)和普通顯微鏡照片（10×100倍）分別見圖2-a和圖2-b。經(jīng)革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)其為革蘭氏陽性菌，菌體呈短桿狀，單個(gè)或成對(duì)排列如圖2-b所示。C10菌株的生理生化指標(biāo)見表1。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）的描述，初步判定該菌株為Bacillus sp。

圖2　菌株C10菌落和革蘭氏染色照片F(xiàn)ig.2Colony and gram stain photos of strain C10

表1　生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1Results of physiology and biochemistry

菌株C10的16S rDNA利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序，將得到的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast，發(fā)現(xiàn)C10菌株與芽孢桿菌屬（Bacillus）最相似。選取基因序列相似度較高的菌株，用Mega5.0建樹如圖3所示。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，該菌株與Bacillus cereus最相似，進(jìn)一步斷定該菌株屬于Bacillus cereus的一支。

圖3　菌株C10的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3Phylogenetic anlysis of strain C10

2.3酯酶酶學(xué)特性研究

2.3.1酯酶作用最適溫度

粗酶液與底物混合，在pH7.0條件下，測(cè)定不同溫度（20℃～70℃）下酯酶活力，結(jié)果如圖4所示。

圖4　溫度對(duì)酯酶活力的影響Fig.4Effect of temperature on the activity of esterase

由圖4可知，在20℃～60℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的升高酯酶的活力逐漸提高，在60℃達(dá)到最高；超過60℃，酶活下降，因此選取60℃為酯酶作用的最適溫度。

2.3.2酯酶作用最適pH

將酶液分別于不同pH（4.0～10.0）的緩沖液中，60℃溫浴，測(cè)定酯酶活力。結(jié)果如圖5所示。

圖5　pH對(duì)酯酶活力的影響Fig.5Effect of pH on the activity of esterase

酯酶在pH 4.0時(shí)活力為零，隨著pH增加酶活提高，在pH9.0時(shí)達(dá)到最大。pH超過9.0，酶活逐漸降低。因此，確定該酶為堿性酯酶，其最適作用pH為9.0。

2.3.3酯酶的熱穩(wěn)定性

將粗酶液分別在不同的溫度下（40℃～80℃）處理1 h，然后冷卻至室溫，測(cè)定該酶相對(duì)于4℃下放置酶液的殘余活力，即以4℃放置的酶液的酶活為100%。結(jié)果如圖6所示。

該酶在40℃下相對(duì)酶活為85.26%，在80℃時(shí)仍具有39.85%的酶活，表明該酶具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.3.4酯酶的pH穩(wěn)定性

將粗酶液在不同pH緩沖溶液中處理24 h，測(cè)定該酶相對(duì)于pH9.0下放置的殘余活力。結(jié)果見圖7。

圖6　酯酶的熱穩(wěn)定性Fig.6The thermal stability of esterase

圖7　酯酶的pH穩(wěn)定性Fig.7The pH stability of esterase

由圖7可知，該酶在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性較弱，相對(duì)酶活較低，而在堿性環(huán)境下隨著pH增加，穩(wěn)定性增加，在pH8.0時(shí)相對(duì)酶活保存74.61%，在pH10.0相對(duì)酶活保存86.87%，而在pH4.0時(shí)相對(duì)酶活保存只有10.62%，說明該酶具有較好的耐堿性。

3結(jié)論與討論

從自然發(fā)酵的黃皮果汁樣品中篩選到一株優(yōu)良酯酶產(chǎn)生菌株C10，酶活達(dá)到24.90 U/mL。通過形態(tài)學(xué)特征，生理生化及16S rDNA基因序列分析，確定該菌為Bacillus cereus。研究了菌株C10所產(chǎn)酯酶的部分酶學(xué)特性，結(jié)果表明，菌株所產(chǎn)酯酶為堿性酯酶，其最適作用溫度為60℃，最適作用pH為9.0，并具有較好的耐熱性和堿穩(wěn)定性。為使菌株C10能穩(wěn)定產(chǎn)酯酶以及產(chǎn)酯酶能力提高，其發(fā)酵特性還有待于進(jìn)一步研究。

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Isolation of Esterase-Producing Strain from Juice of Clausena lansium Skeels and Characterization Study on the Esterase

WANG Wen-wen1，2，ZHANG Dong-feng1，2，TANG Jing-qian3
（1.Department of Food and Bioengineering，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，Guangdong，China；2.Center of Guangdong Higher Education for Engineering and Technological Development of Specialty Condiments，Guangzhou 510300，Guangdong，China；3.Jinan University Library，Guangzhou 510632，Guangdong，China）

To screen out excellent esterase-producing bacteria，we screen it from natural fermentation juice of Clausena lansium（Lour）Skeels.106 strains were isolated by enrichment culture and plate isolation and 1 excellent esterase-producing train C10 was gotted by using glyceryl triacetate as the sole carbon source，shake flask fermentation and enzyme activity determination.Based on the physiological and biochemical test and 16 S rDNA gene sequence analysis，it concludes that the bacteria belong to Bacillus cereus.Then the enzymatic properties were studied and the results showed that it was an alkaline esterase，the optimal temperature and pH of the esterase were 60℃and 9.0 respectively.And The esterase with heat resistance and alkali stability.

Bacillus cereus；esterase；enzymatic properties

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.031

2014-04-17

廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心建設(shè)項(xiàng)目（GCZXB1103）；廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院自然科學(xué)基金項(xiàng)目（KJ201210）

王文文（1982—），女（漢），講師，碩士研究生，從事生物工程方面的研究。