戴琨 王騰飛 郝昭程 湯丹丹 劉紅娟 王瑞明

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，濟(jì)南　250353）

乙酸對(duì)重組大腸桿菌BL21產(chǎn)酶的影響及作用機(jī)理研究

戴琨 王騰飛 郝昭程 湯丹丹 劉紅娟 王瑞明

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，濟(jì)南250353）

旨在研究發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸對(duì)重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET15b-TreS的生長(zhǎng)以及重組海藻糖合酶基因表達(dá)的影響，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行探討。通過外源添加乙酸（鈉）的方法，研究了乙酸鈉對(duì)重組菌BL21（DE3）/pET15b-TreS生長(zhǎng)曲線的影響；利用環(huán)境掃描電子顯微鏡，觀察了重組菌形態(tài)的變化情況；通過測(cè)定菌液的電導(dǎo)率值變化、菌液上清中OD260的變化，研究了乙酸（鈉）對(duì)菌體細(xì)胞膜滲透性、完整性的影響；通過測(cè)定菌液上清中β-半乳糖苷酶的活性檢測(cè)了乙酸鈉對(duì)菌體細(xì)胞內(nèi)膜的影響；利用熒光分析法檢測(cè)了乙酸對(duì)菌體膜蛋白構(gòu)象的影響；采用SDS-PAGE電泳研究了乙酸鈉對(duì)菌體重組海藻糖合酶表達(dá)量的影響。結(jié)果表明，乙酸（鈉）會(huì)對(duì)重組菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用，可以導(dǎo)致菌體細(xì)胞的表面出現(xiàn)凹陷、皺縮；并會(huì)影響細(xì)胞膜的滲透性、完整性，使得一些細(xì)胞內(nèi)容物發(fā)生泄漏；影響細(xì)胞膜上的膜蛋白構(gòu)象，對(duì)膜的結(jié)構(gòu)造成一定程度的破壞；對(duì)重組海藻糖合酶的表達(dá)產(chǎn)生影響。乙酸（鈉）對(duì)重組菌菌體的生長(zhǎng)及重組海藻糖合酶基因的表達(dá)有影響，并且菌體細(xì)胞膜是其作用的一個(gè)靶點(diǎn)。

乙酸；重組大腸桿菌；抑菌機(jī)理；細(xì)胞膜；海藻糖合酶

目前，隨著重組DNA技術(shù)與發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展，利用基因工程菌獲得所需產(chǎn)品的技術(shù)日趨成熟。由于大腸桿菌具有遺傳特性較清楚、易培養(yǎng)、發(fā)酵周期短并能實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)等特性，因而被廣泛應(yīng)用于基因工程菌的構(gòu)建［1］。而重組菌的高細(xì)胞密度發(fā)酵是獲得高外源蛋白產(chǎn)量的一種重要手段，能夠提高單位時(shí)間單位體積的外源蛋白產(chǎn)率，重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng)一般指培養(yǎng)液中菌體干細(xì)胞重量（dry cell weight，DCW）達(dá)50 g/L以上［2］。利用重組大腸桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵可以有效地提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量，但是，大腸桿菌在進(jìn)行高密度發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸，Han［3］認(rèn)為細(xì)菌在低比生長(zhǎng)速率條件下通過氧化代謝作用產(chǎn)生的能量足以滿足合成和異化作用的需求，不會(huì)產(chǎn)生乙酸，而在高比生長(zhǎng)速率時(shí)，大腸桿菌僅靠氧化代謝不能提供足夠的能量，必須通過乙酸生成途徑儲(chǔ)備ATP和NADH2。乙酸的生成需要兩個(gè)關(guān)鍵性的酶，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（Pta）和乙酰激酶（Ack），它們催化葡萄糖代謝中從乙酰輔酶A生成乙酸的兩步酶促反應(yīng)［4］。然而，乙酸的產(chǎn)生和積累不僅會(huì)影響菌體生長(zhǎng)，還會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)和重組基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制［5］。

EL-Mansi［6］和Luli［7］假設(shè)的乙酸抑制機(jī)理為：乙酸在中性pH環(huán)境中以離子化（CH3COO-）和質(zhì)子化（CH3COOH）兩種形式存在，質(zhì)子化的乙酸具有弱的親脂性可以穿過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入胞內(nèi)，在胞內(nèi)（pH7.5）解離成CH3COO-和H+，這樣就降低了膜內(nèi)的pH值，使膜內(nèi)外的pH差（ΔpH）減小，減弱了質(zhì)子推動(dòng)力，產(chǎn)生的能量就被大大減少了，擾亂了細(xì)胞的正常代謝和生理活性。而陰離子增加了細(xì)胞內(nèi)部滲透壓，并干擾甲硫氨酸的合成［8］。有試驗(yàn)證明，培養(yǎng)時(shí)pH越低，乙酸未解離形式含量越高，乙酸抑制作用就越強(qiáng)［9-10］。

此外，研究表明，乙酸會(huì)影響數(shù)種蛋白和基因，特別是那些涉及大腸桿菌轉(zhuǎn)錄及翻譯機(jī)制、一般應(yīng)激反應(yīng)和調(diào)節(jié)的蛋白和基因［11］。而且，乙酸對(duì)產(chǎn)重組蛋白的細(xì)胞抑制作用比對(duì)野生型的細(xì)胞抑制作用更強(qiáng)［12］，同時(shí)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)蛋白后產(chǎn)生乙酸的臨界比生長(zhǎng)速率更低［13］。

在利用重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET15b-TreS進(jìn)行高密度發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖合酶的過程中，發(fā)酵液中會(huì)有大量代謝副產(chǎn)物乙酸的積累，而且會(huì)影響海藻糖合酶的酶活。根據(jù)這些檢測(cè)結(jié)果，本研究采取外源添加的方法，研究乙酸對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)及外源海藻糖合酶基因表達(dá)的影響，并分析其對(duì)細(xì)胞的抑制機(jī)理，包括對(duì)細(xì)胞膜、目的蛋白表達(dá)量的抑制作用，旨在為了解發(fā)酵過程中乙酸對(duì)菌體作用的機(jī)理，以控制培養(yǎng)條件，降低對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 大腸桿菌BL21（DE3）/pET15b-Tres（本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建菌種）。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基（%）：酵母浸粉0.5，蛋白胨1.0，NaCl 1.0。

M9乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基（%）：Na2HPO4·12H2O 1.72，KH2PO40.3，NaCl 0.05，NH4Cl 0.1，MgSO40.05，CaCl20.001，乳糖0.5。

β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液（%）：NaCl 0.8，KCl 0.02，Na2HPO4·12H2O 0.29，KH2PO40.024，MgSO4·7H2O 0.025，β-巰基乙醇 0.39。

氨芐青霉素（Amp）：50 mL無菌水中加入0.5 g氨芐西林鈉（0.5 g/瓶）。

其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)（蘇州安泰技術(shù)有限公司）；電子天平（上海天平儀器廠）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海亞榮生化儀器廠）；往復(fù)式水浴恒溫振蕩器（江蘇正基儀器有限公司）；DDS-11A電導(dǎo)率儀（上海第二分析儀器廠）；紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；ChampGel5 500生物電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（SAGECREATION）；F-4500熒光分光光度計(jì)（日立）；5804R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化培養(yǎng) 配制LB液體培養(yǎng)基經(jīng)121℃滅菌20 min后，冷卻，于培養(yǎng)基中加入Amp（終濃度為100 mg/L）后接菌，37℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。取菌液在加有Amp的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，挑取生長(zhǎng)狀況較好的單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)基擴(kuò)增。

1.2.2 對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響 取活化后的大腸桿菌BL21（DE3）/pET15b-TreS按1%的接種量分別接種于9個(gè)100 mL 加有Amp的LB培養(yǎng)基中，加入滅菌的乙酸鈉溶液，使其終濃度分別為0、0.5、1、2、4、5、10、20和30 g/L，于37℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)，并在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 對(duì)細(xì)胞顯微特征的影響 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的重組菌于5 000 r/min，4℃條件下離心10 min，棄上清，收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3次，并稀釋至菌體濃度約為107CFU/mL。

取制備的重組菌菌懸液20 mL，分別加入乙酸（使其終濃度分別為6.25 g/L和25 g/L）、乙酸鈉溶液（使其終濃度分別為6.72 g/L和26.88 g/L），同時(shí)設(shè)置無菌生理鹽水對(duì)照組，37℃孵育2 h。將對(duì)照組和試驗(yàn)組的重組菌菌液離心收集菌體，洗滌后用2.5%的戊二醛于4℃條件下固定2 h后涂片，使樣品自然風(fēng)干。制備的樣品用環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察重組菌形態(tài)的變化情況。

1.2.4 對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的重組菌菌體，用無菌水稀釋至菌液濃度為107CFU/mL，取稀釋后的菌液27 mL，加入3 mL抑菌成分，分別為乙酸（終濃度分別為：3.125、6.25、12.5和25 g/L）、乙酸鈉（終濃度分別為：3.36、6.72、13.44和26.88 g/L），同時(shí)設(shè)置無菌水對(duì)照組，置于37℃恒溫水浴振蕩器中，然后分別在0、10、20、30、40、50和180 min時(shí)測(cè)定其電導(dǎo)率值。

1.2.5 對(duì)菌體細(xì)胞膜完整性的影響 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的重組菌菌體，用生理鹽水稀釋至菌體濃度為107CFU/mL左右，取稀釋后的菌液45 mL，加入5 mL不同濃度的抑菌成分，分別為乙酸（終濃度分別為：3.125、6.25、12.5和25 g/L）、乙酸鈉（終濃度分別為：3.36、6.72、13.44 和26.88 g/L），并設(shè)置空白對(duì)照組，然后置于37℃恒溫水浴振蕩器中，分別在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，并在6 000 r/min的條件下，離心5 min，取上清用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在260 nm處的吸光值。

1.2.6 對(duì)細(xì)胞內(nèi)膜的滲透性影響 培養(yǎng)重組菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取菌液10 mL進(jìn)行離心，菌體用無菌生理鹽水洗滌兩次，轉(zhuǎn)移至100 mL的M9乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)10 h，然后離心，收集菌體，用β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液重懸至OD600為0.2左右。

取9 mL反應(yīng)緩沖液重懸的菌液，分別加入1 mL不同濃度的乙酸鈉（終濃度分別為：3.36、6.72、13.44和26.88 g/L）混勻，37℃孵育2 h后離心菌體，取上清4.5 mL，再加入500 μL 1 mg/mL的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG），置于37℃恒溫水浴中，孵育2 h后，于420 nm的波長(zhǎng)下測(cè)其吸光值［14］。

1.2.7 熒光分析法測(cè)乙酸對(duì)菌體膜蛋白構(gòu)象的影響 將重組菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心、洗滌菌體，用生理鹽水重懸，濃度約為107CFU/mL，分別在5 mL滅菌的EP管中加入1 mL的菌懸液，然后加入1 mL不同濃度的冰乙酸（乙酸的終濃度依次為0、3.125、6.25、12.5和25 g/L），于37℃恒溫水浴鍋中保溫1h后，置于日立F-4500熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 對(duì)蛋白質(zhì)合成的影響 將重組菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按1%接種量分別接種于100 mL加Amp的 LB液體培養(yǎng)基中，同時(shí)分別加入0.1 g/L滅菌的乙酸鈉溶液，使得乙酸鈉的終濃度分別為0.5、1、2、3、4 和5 g/L，并設(shè)置對(duì)照組，培養(yǎng)8 h后，加入乳糖誘導(dǎo)，誘導(dǎo)12 h后，收集菌體，并進(jìn)行洗滌，將洗滌后的菌體用pH7.4的磷酸緩沖液懸浮至吸光值相同，經(jīng)超聲破碎后離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE。配制濃度為5%的濃縮膠和濃度為12%的分離膠進(jìn)行蛋白電泳，取上清液樣品20 μL與20 μL上樣緩沖液混合，于沸水中煮沸10 min后，進(jìn)行點(diǎn)樣。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響

在一定范圍內(nèi)，菌液的細(xì)胞濃度與吸光度值（OD值）成正比，試驗(yàn)中采用OD600來衡量重組大腸桿菌的細(xì)胞密度。因此，通過測(cè)定OD值的變化來間接地表示乙酸鈉對(duì)重組菌生長(zhǎng)的抑制情況。

乙酸根對(duì)重組大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響結(jié)果（圖1）顯示，在培養(yǎng)基中加入乙酸鈉對(duì)BL21（DE3）/pET15b-Tres的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生影響，菌體的生長(zhǎng)明顯受到抑制，使得菌體生長(zhǎng)的延滯期延長(zhǎng)，且抑制作用隨濃度的增大而增強(qiáng)，而乙酸鈉濃度為0.5 g/L時(shí)，對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制較弱，其他濃度下，0-6 h內(nèi)，生長(zhǎng)較緩慢。在6 h之后，較低濃度（乙酸鈉濃度低于5 g/L）下，菌體生長(zhǎng)受到的抑制減弱，而在較高濃度（乙酸鈉濃度為10、20和30 g/L）下，菌體生長(zhǎng)被嚴(yán)重抑制，生長(zhǎng)依然緩慢。

圖1 不同濃度乙酸鈉對(duì)重組菌生長(zhǎng)曲線的影響

2.2 對(duì)細(xì)胞顯微特征的影響

經(jīng)電子顯微鏡觀察對(duì)照組的重組大腸桿菌的形態(tài)，如圖2中A-1、A-2所示，其細(xì)胞形態(tài)比較完整、飽滿。而試驗(yàn)組中用不同濃度的乙酸、乙酸鈉處理過的重組菌，形態(tài)發(fā)生了不同的變化。其中，用濃度為6.25 g/L和25 g/L的乙酸處理過的菌體形態(tài)如圖2-B、2-C所示，用濃度分別為6.72 g/L和26.88 g/L的乙酸鈉溶液處理過的菌體形態(tài)如圖2-D、2-E所示。圖2-B顯示，菌體基本形態(tài)沒有較大變化，只出現(xiàn)較小的褶皺，而圖2-C中顯示菌體出現(xiàn)皺縮，菌體的形態(tài)受到較大影響。乙酸鈉處理后的細(xì)胞（圖2-D、2-E）顯示，細(xì)胞會(huì)發(fā)生凹陷，隨著乙酸鈉濃度的增大，細(xì)胞受損情況加重。

圖2 環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察乙酸（鈉）對(duì)重組菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.3 對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響

通過測(cè)定菌液電導(dǎo)率的變化可以反映細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化情況。重組菌經(jīng)不同濃度的乙酸、乙酸鈉處理后其菌液電導(dǎo)率的變化情況（圖3-A）表明，菌體加入無菌水的空白對(duì)照組電導(dǎo)率很低，而且變化不大，而實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的乙酸鈉后，菌液的電導(dǎo)率發(fā)生了不同的變化。乙酸鈉是一種強(qiáng)電解質(zhì)，強(qiáng)電解質(zhì)溶液的電導(dǎo)率隨著濃度的增加而升高，當(dāng)濃度增加到一定程度后，解離度下降，離子運(yùn)動(dòng)速率降低，電導(dǎo)率也降低。相同濃度的菌液加入不同濃度的乙酸鈉后，電導(dǎo)率也變得不同，濃度為13.44 g/L時(shí)，電導(dǎo)率最大。濃度繼續(xù)升高電導(dǎo)率先降低后升高，可能是由于電解質(zhì)解離程度高使得乙酸根由于外界壓力進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，導(dǎo)致其先下降，而其他濃度的乙酸鈉加入后，會(huì)使得電導(dǎo)率有所升高，這說明乙酸根導(dǎo)致了細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，內(nèi)容物電解質(zhì)泄露到胞外，其電導(dǎo)率的變化程度相差不大。而圖3-B顯示，加入乙酸后，菌液的電導(dǎo)率均升高，初始電導(dǎo)率隨濃度的增大而增大，升高程度也隨濃度增大而略有增大，說明細(xì)胞膜的破壞程度略有增加。

2.4 對(duì)菌體細(xì)胞膜完整性的影響

通過測(cè)定經(jīng)不同處理后的菌液上清在260 nm處的吸光度值變化推測(cè)菌體細(xì)胞膜的完整性變化情況。重組菌經(jīng)不同濃度的乙酸（鈉）處理后菌液上清的OD260變化情況（圖4-A）表明，空白對(duì)照組的菌液上清OD260沒有升高，且變化較小，而實(shí)驗(yàn)組的OD260變化比較大，且高于對(duì)照組，說明實(shí)驗(yàn)組的菌體細(xì)胞膜完整性受到影響，有DNA等物質(zhì)的泄露；由于乙酸鈉是強(qiáng)電解質(zhì)，濃度太高會(huì)抑制其電解率，而濃度為26.88 g/L和6.72 g/L時(shí)，趨勢(shì)相似，變化程度接近，推測(cè)其電解率相近。而濃度為13.44 g/L和3.36 g/L時(shí)，OD260值變化不大；濃度為13.44 g/L時(shí)，可能是由于乙酸鈉的電離及乙酸根的水解程度較大，會(huì)有大量的質(zhì)子化的乙酸根進(jìn)入細(xì)胞，對(duì)膜的完整性影響較小，而濃度為3.36 g/L時(shí)，濃度較低則對(duì)膜完整性的影響較小。乙酸添加情況（圖4-B）表明，前200 min，變化情況較復(fù)雜，無明顯的趨勢(shì)，之后可以看到試驗(yàn)組的OD260高于對(duì)照組，且隨濃度增大而升高，說明乙酸會(huì)影響菌體細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致DNA等大分子物質(zhì)的泄露，且隨濃度升高作用增強(qiáng)。

圖3 不同濃度乙酸鈉（A）及乙酸（B）對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響

圖4 不同濃度乙酸鈉（A）及乙酸（B）對(duì)重組菌細(xì)胞膜完整性的影響

2.5 對(duì)細(xì)胞內(nèi)膜的滲透性影響

通過測(cè)定菌液上清中的β-半乳糖苷酶的活性，來檢測(cè)胞內(nèi)大分子滲透至胞外的情況，進(jìn)而說明細(xì)胞內(nèi)膜的受損情況。菌液添加乙酸鈉作用后，離心菌體，取上清測(cè)定β-半乳糖苷酶的酶活性，結(jié)果（圖5）顯示，加入乙酸鈉作用于菌體后，上清中β-半乳糖苷酶的酶活高于對(duì)照組，說明乙酸根對(duì)于細(xì)胞內(nèi)膜有一定的破壞作用，導(dǎo)致β-半乳糖苷酶滲漏到胞外，而不同濃度的乙酸鈉對(duì)其作用效果相差不大。

2.6 熒光分析法測(cè)乙酸對(duì)菌體膜蛋白構(gòu)象的影響

通過熒光分析法檢測(cè)乙酸對(duì)菌體上的膜蛋白及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果（圖6）表明，KI作用后，熒光強(qiáng)度降低，說明能與細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)色氨酸Trp殘基結(jié)合，同時(shí)熒光強(qiáng)度逐漸降低，由此可以推斷，色氨酸Trp殘基位于細(xì)胞膜的表面和內(nèi)部，當(dāng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)，膜內(nèi)部的Trp殘基就會(huì)暴露出來與KI結(jié)合。圖7結(jié)果顯示，隨著乙酸濃度的增大，Trp殘基的熒光強(qiáng)度相應(yīng)的依次減少，表明乙酸對(duì)Trp的熒光特性具有淬滅作用。而激發(fā)峰的位置和圖形基本上沒有變化，這表明乙酸能夠改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使位于細(xì)胞膜內(nèi)的Trp殘基暴露于細(xì)胞膜外。

圖5 乙酸鈉對(duì)細(xì)胞內(nèi)膜通透性的影響

圖6 KI對(duì)重組菌膜蛋白熒光特性的影響

圖7 乙酸對(duì)重組菌膜蛋白熒光發(fā)射強(qiáng)度的影響

2.7 對(duì)蛋白質(zhì)合成的影響

圖8顯示，加入低濃度的乙酸鈉，海藻糖合酶的表達(dá)量會(huì)增大，推測(cè)是由于乙酸根進(jìn)入胞內(nèi)，會(huì)作為碳源參與到菌體的代謝中，因而其表達(dá)量增大，但隨著濃度的繼續(xù)增大，乙酸的抑制作用也會(huì)表現(xiàn)出來，海藻糖合酶的表達(dá)量則隨著乙酸鈉濃度的增大而減小，說明乙酸鈉會(huì)對(duì)海藻糖合酶的表達(dá)產(chǎn)生抑制。

圖8 乙酸鈉作用后的重組菌蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

3 討論

在利用重組大腸桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵的過程中，發(fā)酵液中會(huì)有代謝副產(chǎn)物乙酸的積累，乙酸的存在抑制工程菌的生長(zhǎng)及外源基因的表達(dá)［15］。乙酸對(duì)重組大腸桿菌的抑制作用已有報(bào)道，本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的這一現(xiàn)象，進(jìn)行了更加深入的理論基礎(chǔ)研究，對(duì)乙酸的抑制作用機(jī)理進(jìn)行了探討。

研究中發(fā)現(xiàn)，在加入乙酸鈉的環(huán)境中，菌體會(huì)出現(xiàn)一定的適應(yīng)期，較低濃度（0.5、1和2 g/L）的乙酸鈉對(duì)菌體影響較小，并且可能是由于質(zhì)子化的乙酸根進(jìn)入細(xì)胞后，可以作為碳源參與到細(xì)胞內(nèi)的代謝中，供菌體生長(zhǎng)所用，所以會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)稍有促進(jìn)；而在較高乙酸鈉濃度下，菌體細(xì)胞或其代謝過程可能會(huì)被破壞，因而菌體生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。本研究首先研究了乙酸、乙酸鈉對(duì)重組大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)及顯微特征的影響，發(fā)現(xiàn)菌體會(huì)發(fā)生皺縮或者凹陷，有些菌體周圍可以看出類似發(fā)生了內(nèi)容物的外泄，這可能是由于乙酸、乙酸鈉引起了菌體細(xì)胞膜的破壞，進(jìn)而導(dǎo)致了菌體形態(tài)的變化甚至內(nèi)容物的外泄。

根據(jù)上述現(xiàn)象，通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了乙酸、乙酸鈉對(duì)于菌體細(xì)胞膜的影響，細(xì)菌的細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜遭到破壞，使得其半透性及流動(dòng)性降低時(shí)，細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性會(huì)被破壞，從而導(dǎo)致內(nèi)部的電解質(zhì)（如K+）外滲，培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升［16］。細(xì)菌細(xì)胞膜是細(xì)菌的結(jié)構(gòu)組分，不僅是細(xì)胞的保護(hù)屏障，也是在細(xì)胞的生命活動(dòng)中有著復(fù)雜功能的重要結(jié)構(gòu)。當(dāng)細(xì)胞膜遭到破壞時(shí)，首先細(xì)胞內(nèi)的小分子物質(zhì)外滲出來，然后是DNA和RNA等一些大分子的外滲，而DNA和RNA在260 nm處有強(qiáng)吸收，因此，對(duì)260 nm吸收物質(zhì)的檢測(cè)被廣泛應(yīng)用于測(cè)定細(xì)胞膜的完整性［17］。測(cè)定處理后菌液電導(dǎo)率的變化反映了細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化，通過測(cè)定處理后菌液上清在260 nm處的吸光度值變化推測(cè)菌體細(xì)胞膜的完整性變化，而這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較復(fù)雜，分析可能涉及到乙酸、乙酸鈉的解離和水解問題，但結(jié)果說明菌體細(xì)胞膜的通透性與完整性都會(huì)受到一定的影響。

細(xì)菌在受到乳糖誘導(dǎo)后均可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶是位于細(xì)胞內(nèi)的水解酶，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。鄰硝基苯 β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）是乳糖的類似物，β-半乳糖苷酶可以將ONPG 水解成半乳糖和黃色的鄰-硝基苯酚，因此可以通過顏色的變化測(cè)知β-半乳糖苷酶的活性［18］。實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定菌液上清中的β-半乳糖苷酶的活性，來檢測(cè)胞內(nèi)大分子滲透至胞外的情況，進(jìn)而說明細(xì)胞內(nèi)膜的受損情況，不同濃度的乙酸鈉對(duì)其作用后會(huì)有影響，但差別較小。

蛋白質(zhì)分子中因含有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）等氨基酸殘基而產(chǎn)生內(nèi)源性熒光。在大多數(shù)情況下，可以認(rèn)為蛋白質(zhì)所顯示的熒光主要來自色氨酸殘基，其變化直接反映了蛋白質(zhì)中色氨酸殘基本身及其周圍環(huán)境的變化。當(dāng)某些小分子如藥物等物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度下降，稱為熒光淬滅作用［19］。根據(jù)Trp的激發(fā)波長(zhǎng)Ex，固定Ex，通過日立F-4500熒光分光光度計(jì)在310-450 nm范圍內(nèi)掃描即可確定Trp在重組大腸桿菌膜蛋白中的發(fā)射波長(zhǎng)Em。

為了確定Trp在重組大腸桿菌膜中的位置，需要將猝滅劑KI（1 mol/L）稀釋成不同濃度（0、0.01、0.02、0.05 和0.1 mol/L）加入，檢測(cè)對(duì)Trp發(fā)射波長(zhǎng)Em的峰位和峰高的影響。如果Em迅速降低，則表明該氨基酸殘基位于表面，如果Em變化不大，則表明該氨基酸殘基位于膜內(nèi)，如果Em逐漸降低，就表明該氨基酸殘基的位置有兩種可能，可能是在膜內(nèi)也有可能是在膜外［20］。結(jié)果表明乙酸能夠改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使位于細(xì)胞膜內(nèi)的Trp殘基暴露于細(xì)胞膜外。這個(gè)結(jié)論比較明確地說明了乙酸會(huì)對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響其功能。

在研究乙酸鈉對(duì)蛋白合成的影響時(shí)，可以看到明顯的趨勢(shì)，低濃度下乙酸鈉的添加會(huì)促進(jìn)海藻糖合酶的表達(dá)量，而高濃度的乙酸鈉又會(huì)起到抑制作用。其原因可能是乙酸根會(huì)影響DNA的復(fù)制或表達(dá)，也可能是乙酸鈉使菌體細(xì)胞膜受到損壞，導(dǎo)致一部分酶發(fā)生了外泄造成的。

在研究過程中，采用的是菌液中外源添加乙酸、乙酸鈉的方法，由于乙酸在溶液中的存在形式有乙酸分子形式及乙酸根形式，則試驗(yàn)中分別對(duì)兩種形式進(jìn)行了研究，添加乙酸、乙酸鈉至所需的濃度后，菌液的pH變化與對(duì)照組相差較小，因此主要考慮了乙酸、乙酸根的影響。

據(jù)已有的研究表明，某些抑菌劑可與細(xì)菌染色體DNA發(fā)生相互作用，導(dǎo)致DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)受到抑制［21，22］。本試驗(yàn)中乙酸會(huì)影響海藻糖合酶的表達(dá)量，這可能是由于乙酸對(duì)胞內(nèi)DNA、RNA等產(chǎn)生抑制作用直接影響其表達(dá)量，也可能是由于隨著乙酸濃度的增大，重組菌細(xì)胞的通透性、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化，導(dǎo)致部分蛋白發(fā)生泄露，因而影響了目的蛋白的含量。具體的機(jī)制還需要今后做進(jìn)一步研究，進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

根據(jù)發(fā)酵過程中的檢測(cè)初步研究了乙酸（鈉）對(duì)重組大腸桿菌的抑制作用及部分作用機(jī)理。通過外源添加乙酸（鈉）的方法，對(duì)重組菌的生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、蛋白表達(dá)等方面進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，乙酸（鈉）作用于重組菌后，可使其生長(zhǎng)受到抑制，且隨濃度的不同而發(fā)生變化；細(xì)胞膜的通透性會(huì)有所增加，細(xì)胞膜的完整性及膜的結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致部分細(xì)胞內(nèi)容物發(fā)生泄露；菌體正常形態(tài)發(fā)生變化；重組海藻糖合酶的表達(dá)受到影響。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Study on Effects of Acetic Acid on Enzyme Production of the Recombinant Escherichia coli BL21 and Its Action Mechanism

Dai Kun Wang Tengfei Hao Zhaocheng Tang Dandan Liu Hongjuan Wang Ruiming
（Department of Biology Engineering，QILU University of Technology，Ji’nan250353）

Our objective is to study the effects of acetic acid from fermentation on the growth of the recombinant Escherichia coli BL21（DE3）/pET15b-TreS as well as the expression of the recombinant trehalose synthase gene， and the action mechanism was also discussed. Firstly， we studied the effect of acetic acid on the growth of recombinant Escherichia coli by experiments with adding acetic acid（sodium acetate）， and observed the morphological changes of recombinant bacteria by using environmental scanning electron microscope. Then， the effects of acetic acid（sodium acetate）on the permeability and the integrity of cell membrane were studied through the determination of electrical conductivity of the broth and the changes of OD260of the supernatant. The activity of β-galactosidase in the supernatant was measured to determine the effect of sodium acetate on intracellular membrane， and then the influence of acetic acid on the conformation of membrane protein by using fluorescence analysis were detected. Finally， the effect of sodium acetate on the expression of the recombinant trehalose synthase gene by SDS-PAGE was studied. Results showed that the acetic acid（sodium acetate）could have certain inhibition effects on the recombinant bacteria growth， and caused cell surface to be depressed and shrinkage. The permeability and integrity of cell membranes were affected by the acetic acid（sodium acetate）， leading some substances in cells to leak out. And experiments also revealed that the acetic acid could make effects on the conformation of the membrane protein in the cell membrane， which caused a certain degree of damages to the membrane structure. SDS-PAGE analysis suggested that the sodium acetate had impacts on the expression of the recombinant trehalose synthase gene. The acetic acid（sodium acetate）was confirmed to affect the cell growth and the expression of the recombinant trehalose synthase gene， and the cell membrane was a target of its function.

acetic acid；Recombinant Escherichia coli；antimicrobial mechanism；cell membrane；trehalose synthase

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.032

2014-08-14

山東省科技發(fā)展計(jì)劃（2011GGB01160）

戴琨，女，碩士研究生，研究方向：微生物酶技術(shù)；E-mail：daikun1989@126.com

王瑞明，博士，教授，研究方向：微生物酶技術(shù)；E-mail：ruiming3k@163.com