北京市藥品檢驗(yàn)所（100035）李輝

黃曲霉毒素（Aflations，簡(jiǎn)稱AFs）是食品和藥用植物中最為常見霉菌毒素黃曲霉（Aspergillus. favus）和寄生曲霉菌（Aspergillus. parasiticus）的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]。其污染范圍廣泛，存在于花生、玉米、小麥以及中藥材等產(chǎn)品中。AFs的基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素，黃曲霉毒素B1（AFB1）是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌铮幸粋€(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀?，前者為基本有毒性成分結(jié)構(gòu)，后者屬于引起致癌性作用的有效基團(tuán)[2]。AFB1是一種劇毒和強(qiáng)致癌性物質(zhì)，主要作用的靶器官是肝臟，能夠引起慢性肝炎、肝壞死及肝硬化等肝臟疾病[3]。

目前，已有檢測(cè)AFs含量的方法主要分為下列幾種，一類是以色譜技術(shù)為基礎(chǔ)的理化檢測(cè)方法，即生物鑒定法和儀器檢測(cè)法[4]。儀器檢測(cè)法包括薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）等；另一類是應(yīng)用免疫層析技術(shù)的化學(xué)檢測(cè)方法，包括放射免疫法（RIA）、免疫親和柱法（IAC）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）以及試紙條法等。由于常規(guī)儀器分析技術(shù)不能滿足毒素快速篩查目標(biāo)，試紙條檢測(cè)法應(yīng)運(yùn)而生。但是，中藥材自身化學(xué)組分復(fù)雜，基質(zhì)干擾大，常對(duì)試紙條檢測(cè)結(jié)果造成假陽(yáng)性的干擾。因此，本文以蓮子、當(dāng)歸、山楂、麥芽及大黃為研究對(duì)象，初步探討試紙條檢測(cè)技術(shù)在中藥中AFB1快速檢測(cè)應(yīng)用及影響因素，為建立中藥中AFB1快速檢測(cè)方法提供參考。

1 膠體金免疫層析技術(shù)在中藥材真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

膠體金免疫層析技術(shù)是20世紀(jì)80年代繼熒光素標(biāo)記技術(shù)、放射性同位素標(biāo)記技術(shù)及酶標(biāo)記之后發(fā)展起來(lái)一種固相快速免疫診斷技術(shù)[5]。該技術(shù)利用金納米顆粒作為示蹤物，以抗原結(jié)合抗體表現(xiàn)出的直觀顏色變化來(lái)判定樣品中是否含有抗原，從而達(dá)到檢測(cè)目的。

目前，膠體金免疫層析技術(shù)以其高特異性、高靈敏性、方便快速檢測(cè)應(yīng)用于食品、藥品等快速檢測(cè)中[6]。但是，應(yīng)用此技術(shù)用于檢測(cè)中藥中的真菌毒素研究尚未報(bào)道。大多由于中藥自身化學(xué)成分復(fù)雜、基質(zhì)干擾較大并需要繁瑣的前處理?xiàng)l件，以至于研究者很少關(guān)注中藥材真菌毒素快速檢測(cè)。隨著中藥的國(guó)際化，中藥出口的問題化也越來(lái)越嚴(yán)重，中藥“治病”和“產(chǎn)病”一直是大家關(guān)心的話題。大量研究表明中藥材易被真菌毒素（如：黃曲霉毒素，赭曲霉毒素等）污染[7]。所以，建立一種快速便捷的中藥材真菌毒素檢測(cè)方法勢(shì)在必行。膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用的范圍越來(lái)越廣泛，今后，利用膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)中藥材中真菌毒素將是篩查真菌毒素污染的最好方法。

2 試紙條法對(duì)中藥材選取影響

中藥材中可能存在的外源性污染主要包括真菌毒素殘留、農(nóng)藥殘留、重金屬及有害元素殘留等[8]。中藥中的有害殘留物主要來(lái)自于藥用植物在生長(zhǎng)過程中接觸的土壤、水、大氣等自然環(huán)境和炮制、加工、運(yùn)輸、貯藏等過程中的污染。為了監(jiān)測(cè)和控制真菌毒素的污染，同時(shí)保障人類的身體健康。簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的真菌毒素分析方法的建立是近年的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

由于，中藥材所含化學(xué)成分種類多，基質(zhì)復(fù)雜，而真菌毒素的分析又屬于痕量分析，大大增加了檢測(cè)難度。而膠體金免疫層析技術(shù)是金顆粒作為標(biāo)記物，以特異性的抗原和抗體結(jié)合反應(yīng)而表現(xiàn)出的顏色變化，來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果的，待測(cè)物結(jié)構(gòu)與最終制備的試紙條靈敏度關(guān)系甚大。中藥材中不乏有些化學(xué)成分與AFB1的結(jié)構(gòu)相似，常常會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性。為避免假陽(yáng)性事件的發(fā)生，選擇合適的中藥至關(guān)重要。

另一方面，我國(guó)藥用植物資源豐富，臨床常用的預(yù)防治療疾病的植物多達(dá)700多種，不可能把所有中藥都作為研究對(duì)象。因此，優(yōu)選常見大宗藥材作為前期研究對(duì)象可為今后建立其他中藥中AFB1快速篩查提供依據(jù)。

2.1 中藥藥用功效研究 選取即可藥用又可日常保健的中藥作為研究對(duì)象，這類中藥兼具保健、食補(bǔ)、強(qiáng)身、健體多重功效，現(xiàn)實(shí)生活使用頻率較高。選取此類中藥不僅可以提高中藥品質(zhì)，也能夠保障人類身體用藥安全[9][10][11][12]13]。同時(shí)，對(duì)補(bǔ)充和完善中藥AFB1快速檢測(cè)方法非常必要。本文以蓮子、當(dāng)歸、山楂、麥芽及大黃為研究對(duì)象，其性效用見附表1。

附表1 5種中藥藥性效用分析

附表2 選取的5種中藥化學(xué)成分分析

附表3 中藥的基質(zhì)效應(yīng)考察

2.2 中藥的化學(xué)成分研究 在選取中藥時(shí)，化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)中藥中黃曲霉毒素B1的快速篩查的影響大。由于AFB1結(jié)構(gòu)含有香豆素類成分，所以，應(yīng)用膠體金免疫層析試紙條會(huì)對(duì)含有香豆素類成分的中藥檢測(cè)的假陽(yáng)性出現(xiàn)率高。5種中藥所含的化學(xué)成分見附表2。可以看出，中藥化學(xué)組分中不含有香豆素類成分，可能對(duì)試紙條檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性率影響較小。

2.3 中藥的基質(zhì)效應(yīng)考察 中藥材基質(zhì)效應(yīng)是造成試紙條檢測(cè)假陽(yáng)性重要原因，同時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)簡(jiǎn)單的藥材對(duì)制備的試紙條前處理液有良好的適應(yīng)性?？疾爝x取的5種中藥的基質(zhì)效應(yīng)影響。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下。

①將藥材粉碎，過40目篩，精密稱取供試品粉末2g，加入10mL甲醇-水（80:20，v/v），浸泡20min，渦旋振蕩10min，5000rpm離心5min；②精密吸取500μL上清液經(jīng)N2吹干，配制成低、中、高三個(gè)濃度水平的加標(biāo)溶液，其中AFB1的加標(biāo)水平為1，5，25ng/mL，將制得樣品液；③采用UPLC-MS/MS進(jìn)行分析檢測(cè)，每個(gè)濃度2份，每份樣品重復(fù)測(cè)定3次；再用色譜甲醇配制相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度2份，進(jìn)樣分析，按照以下公式基質(zhì)效應(yīng)（ME%）=（加標(biāo)樣品峰面積/標(biāo)品峰面積）×100%[14]計(jì)算兩組峰面積的比值，分別考察5種藥材的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見附表3。中藥材的基質(zhì)效應(yīng)影響小，藥材中AFB1經(jīng)一步提取法檢測(cè)時(shí)受基質(zhì)效應(yīng)的影響越小。簡(jiǎn)單的樣品檢測(cè)液也能保證在制備的試紙條上順利地完成檢測(cè)過程。

3 討論

AFB1是由黃曲霉菌和寄生曲霉產(chǎn)生的刺激代謝產(chǎn)物，為有害致癌性物質(zhì)。其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易被分解，毒性強(qiáng)，可通過食物鏈在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)移并蓄積。不斷堆積的AFB1不僅給農(nóng)作物生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失，而且嚴(yán)重危害人類的身體健康。隨著，中藥材國(guó)際化進(jìn)程的加快，中藥的質(zhì)量安全和品質(zhì)保證成為關(guān)注的熱點(diǎn)話題。為保障人類健康不受危害，需要通過一種快速檢測(cè)的手段對(duì)真菌毒素進(jìn)行初步篩查。膠體金免疫層析技術(shù)以其快速、靈敏、便捷、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)受到廣泛的重視。

由于免疫層析技術(shù)并沒有在中藥檢測(cè)方面得到廣泛地應(yīng)用。因此，在中藥材作為檢測(cè)研究對(duì)象時(shí)，一般需要遵循以下原則：①選取常見大宗中藥中易污染黃曲霉毒素的中藥作為研究對(duì)象。②剔除化學(xué)成分上與AFB1結(jié)構(gòu)相似的中藥，如理化結(jié)構(gòu)中含有香豆素類成分不作為本次實(shí)驗(yàn)的研究品種。③選取即可藥用又可日常保健的中藥作為研究對(duì)象，這類中藥多具保健、食補(bǔ)、強(qiáng)身、健體多重功效，現(xiàn)實(shí)生活使用頻率較高。選取這類藥物不僅可以提高中藥品質(zhì)，而且，能夠保障人類身體用藥安全。