汪　慧，錢巧珍，王　靜，顧亞琴，舒　燕，酈紅巖

HPLC法同時測定地錦草中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的含量

汪慧，錢巧珍，王靜，顧亞琴，舒燕，酈紅巖

目的 建立同時測定地錦草藥材中蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷含量的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定方法。方法 色譜柱： Kromasil C18（5 μm，250×4.6 mm）；流動相：乙腈-水-冰醋酸（20:80:0.15）；流速為1.0 ml/min，檢測波長：360 nm，柱溫：30 ℃。結(jié)果 蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷三種成分的相對保留時間分別約為8.1、10.5、16.1 min，能夠達到基線分離，分離度分別為2.8、4.1、3.8；回收率分別為100.43%、100.34%、100.32%；線性范圍分別為0.660～21.200、0.486～15.560、0.480～15.200 μg。結(jié)論 HPLC測定法簡便準確，重復性好，為地錦草的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

地錦草；蘆丁；異槲皮苷；紫云英苷；高效液相色譜法

地錦草為大戟科植物地錦Euphorbia humifusa Willd.或班地錦Euphorbia maculata L.的干燥全草，是中醫(yī)、維醫(yī)常用藥材，藥用價值高，具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃功效，可用于治療痢疾、泄瀉、咯血、尿血，便血、崩漏、瘡癤癰腫、濕熱黃疸［1-3］。其主要成分有黃酮類、三萜類、香豆素類、甾醇類、鞣質(zhì)及酚酸類化合物。目前，對地錦草中黃酮類成分的含量測定報道較多，2010版《中國藥典》也將槲皮素列為其含量檢測指標，但未見同時測定地錦草中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷含量的報道，本研究通過參考相關(guān)文獻［4-6］，對地錦草中的這3種成分進行了含量測定，為地錦草的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料 島津LC-10A高效液相色譜儀，LC-10ATVP泵，SPD-10AVP可見紫外檢測器；浙大智達N2000雙通道色譜工作站；Satorius CP225D電子天平；Branson SB3200超聲波清洗器；金壇中大HH恒溫水浴鍋。

蘆丁對照品（購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：100080-200707）、異槲皮苷（購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：111809-201403）、紫云英苷對照品（購自上海源葉生物科技有限公司，批號：20130420），乙腈、冰醋酸為色譜純，水為注射用水，其余試劑均為分析純。地錦草藥材（購自江蘇九泰醫(yī)藥有限公司）經(jīng)江蘇大學歐陽臻教授鑒定。

1.2方法

1.2.1色譜條件 色譜柱：Kromasil C18（5 μm，250× 4.6 mm）；流動相：乙腈-水-冰醋酸（20：80：0.15）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30oC；檢測波長：360 nm；進樣20 μl。理論板數(shù)：按蘆丁峰計算應不低于3000。

1.2.2對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷對照品適量，加乙睛-水溶液（90∶10）制成含蘆丁、異槲皮苷及紫云英苷均為0.1 mg/ml的混合溶液，即得對照品溶液。

1.2.3供試品溶液的制備 取地錦草藥材，粉碎，過篩，精密稱取2.0 g，置索氏提取器中，加石油醚（60～90℃）回流至無色，棄去醚液，藥渣揮至無醚味，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，精密加70%乙醇50 ml，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 ml，置25 ml量瓶中，加流動相定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

1.2.4線性關(guān)系的考察 精密吸取不同濃度的對照品溶液注入液相色譜儀，以進樣量（μg）為橫坐標（X），以峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標（Y），進行線性回歸，繪制標準曲線，計算得回歸方程。

1.2.5精密度試驗 精密吸取同一濃度的混合對照品溶液，依法測定，連續(xù)進樣5次，測定峰面積，考察其精密度。

1.2.6供試液穩(wěn)定性試驗 取同一供試液樣品，分別在0、2、4、6、8、12、24 h測定峰面積，計算每一成分峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），觀察其在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性情況。

1.2.7重復性試驗 分別精密稱取同一份藥材樣品6份，按“供試品溶液的制備”項步驟操作，測定，計算樣品中各成分的含量以及RSD。

1.2.8回收率測定 精密稱取已知含量的樣品6份約1.0 g，分別加入蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷對照品溶液，按“供試品溶液的制備”項下步驟處理，得供試品溶液。進樣，計算各成分的回收率情況。

1.2.9樣品測定 分別精密稱取不同批次的地錦草藥材，按“供試品溶液的制備”項下操作、測定，計算藥材中各成分的含量。

2　結(jié) 果

2.1線性關(guān)系的考察 蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷三種成分的相對保留時間分別約為8.1、10.5、16.1 min左右，能夠達到基線分離，分離度分別為2.8、4.1、3.8。蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷對照品的標準曲線的回歸方程見表1。蘆丁在0.660～21.200 μg、異槲皮苷在0.486～15.560 μg、紫云英苷在 0.480～15.200 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1　蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷對照品的標準曲線

2.2精密度試驗 各成分的精密度良好，蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的RSD分別為1.24%、1.43%、1.34%。

2.3供試液穩(wěn)定性試驗 樣品在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，各成分峰面積RSD分別為1.86%、1.63%、1.75%。

2.4重復性試驗 6份供試品中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷平均含量分別為15.187、22.453、9.264 mg/g，RSD分別為1.48%、1.53%、1.79%。

2.5回收率測定 加樣回收率數(shù)據(jù)見表2。

2.6樣品測定 不同批次的地錦草藥材中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的含量數(shù)據(jù)見表3。

圖1　蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷對照品與供試品溶液的色譜圖

表2　蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷加樣回收率試驗結(jié)果

表3　不同批次樣品中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷含量測定結(jié)果（mg/g）

3　討 論

藥材中同時測定蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的含量的報道較多［7，8］，但大多采用梯度洗脫來對樣品進行分離，本研究經(jīng)過篩選，采用等度洗脫來進行含量測定，簡化了方法，降低了對儀器的使用要求，并獲得了滿意的效果。

流動相的選擇：筆者曾對甲醇-乙腈-水、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水-冰醋酸等流動相分別進行系統(tǒng)篩選優(yōu)化，最后確定采用乙腈-水-冰醋酸系統(tǒng)作為流動相，并且對乙腈-水-冰醋酸的比例進行了調(diào)整試驗，最終在乙腈-水-冰醋酸（20∶80∶0.15）的條件下，三種指標成分能夠很好的達到基線分離，出峰時間適中，且其他成分對測定無干擾。樣品提取條件的選擇：在研究過程中分別進行了不同溶劑（甲醇、乙醇、50%乙醇、70%乙醇）、不同提取方法（加熱回流、超聲提?。┖筒煌崛r間（0.5、1、1.5 h）的比較，最后確定以70%乙醇回流提取1 h較為合適，提取時間較短，有效成分不能完全提取，時間較長則有效成分被損耗。

［1］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）［M］. 2010版. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2010： 118.

［2］王婷婷， 文今福， 金松南. 地錦草的化學成分及藥理作用研究進展［J］. 泰山醫(yī)學院學報， 2012， 33（8）： 629-632.

［3］謝 奇， 李治建， 斯拉甫·艾白， 等. 地錦草化學成分及其抗真菌作用的研究進展［J］. 醫(yī)藥導報， 2011， 30（7）： 880-883.

［4］呂鳳蓮，宋韶錦，方 彬. HPLC法測定地錦草中蘆丁的含量［J］. 齊魯藥事， 2010， 29（3）： 139-140.

［5］李 慧， 許 亮， 徐保利， 等. 5種地錦草藥材中總黃酮及3個酚酸類成分測定研究［J］. 中成藥， 2012， 34（ 7）： 1328-1332.

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［7］邸 學， 谷麗艷， 王海波， 等. HPLC同時測定桑葉中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素含量［J］.中國實驗方劑學雜志， 2014， 20（15） ： 92-95.

［8］王 幻， 唐 輝， 王國軍， 等. HPLC測定天山花楸葉提取物中6種黃酮成分［J］. 中國實驗方劑學雜志， 2014，20（15） ： 58-61.

（2015-03-10收稿 2015-04-15修回）

（責任編輯 張亞麗）

Simultaneous determination of contents of Rutin， Isoquercitrin and Astragalin in Herba Euphorbia by HPLC

WANG Hui， QIAN Qiaozhen， WANG Jing， GU Yaqin， SHU Yan， and LI Hongyan. Jiangsu Jibeier Pharmaceutical Joint Stock Limited Liability Company， Zhenjiang 212009， China

Objective To establish high performance liquid chromatography （HPLC） for simultaneously determinating the contents of rutin， isoquercitrin， astragalin in Herba Euphorbia. Methods The chromatographic column was Kromasil C18 （5 μm， 250×4.6 mm）； mobile phase was composed of acetonitrile-water-glacial acetic acid （20:80:0.15）； detection wavelength （360 nm）； column temperature （30℃）.Current speed was 1.0 ml/min. Results Relative retention time of rutin， isoquercitrin， astragalin were 8.1， 10.5 and 16.1 respectively， which can achieve the baseline separation， and the separation degree were 2.8， 4.1， 3.8， respectively； recovery rate were 100.43%， 100.34% and 100.32%， respectively； linear range of methods were 0.660～21.200， 0.486～15.560， 0.480～15.200 μg. Conclusions HPLC was simple， accurate and repeatable， and may provide the basis for quality control of Herba Euphorbiac.

Herba Euphorbia； Rutin； Isoquercitrin； Astragalin； high performance liquid chromatography

LI Hongyan， E-mail: lhy707@126.com

R284.1

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.09.009

汪 慧，本科學歷，工程師，E-mail： 5062342765@qq.com

212009 鎮(zhèn)江，江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司

酈紅巖，E-mail： lhy707@126.com