程愛(ài)芳，鄧政東，陳　文，周念波，黃芳一

（武漢生物工程學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430415）

多粘類芽孢桿菌HD-1產(chǎn)纖維素酶的條件優(yōu)化

程愛(ài)芳，鄧政東*，陳文，周念波，黃芳一

（武漢生物工程學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430415）

采用DNS比色法，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)多粘類芽孢桿菌HD-1產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基主要成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：該菌種產(chǎn)纖維素酶的最適培養(yǎng)基為麩皮0.5%、酵母膏1.25%、磷酸二氫鉀0.04%、硫酸鎂0.1%，培養(yǎng)基初始pH8.0；最適培養(yǎng)條件為接種量4%，培養(yǎng)溫度35℃，培養(yǎng)時(shí)間51h。在此優(yōu)化條件下，多粘類芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶活性可達(dá)88.3U/mL。

多粘類芽孢桿菌HD-1，纖維素酶，發(fā)酵條件，優(yōu)化

纖維素是地球上最豐富的可再生資源［1］。我國(guó)的纖維素類資源極為豐富，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中每年產(chǎn)生大量的皮殼和秸稈［2-3］，這些原料大部分被燒掉，不僅能量利用率低，而且對(duì)生態(tài)平衡和環(huán)境污染產(chǎn)生了極為不利的影響［4-6］。纖維素被徹底分解且不造成污染的有效途徑之一，就是利用纖維素酶的水解作用。纖維素酶（Cellulase）是一類能夠降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱。纖維素的有效利用依賴于人們對(duì)纖維素酶的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)。目前，世界上許多國(guó)家正在積極探索如何轉(zhuǎn)化這一巨大資源［7-8］。

多粘類芽孢桿菌是一類重要的植物生防細(xì)菌和根際促生菌，目前認(rèn)為對(duì)人和動(dòng)植物沒(méi)有致病性［9］。2002年，美國(guó)環(huán)保署（EPA）將其列為可商業(yè)應(yīng)用的微生物之一，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將其列為免做安全鑒定的一級(jí)菌種［10］。多粘類芽孢桿菌可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，如酶、抗菌物質(zhì)、植物激素以及絮凝劑等，因此，多粘類芽孢桿菌是極具開(kāi)發(fā)前景的生防細(xì)菌［11］。

目前對(duì)多粘類芽孢桿菌的研究，主要集中在其作為植物生防細(xì)菌和根際促生菌［12］、代謝活性物質(zhì)的種類、抗菌機(jī)理、基因的克隆分析和表達(dá)［13］等方面，對(duì)其能產(chǎn)生多種水解酶的研究并不全面，尤其未見(jiàn)多粘類芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以多粘類芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，以提高其產(chǎn)酶活力，為多粘類芽孢桿菌后續(xù)的深度開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

多粘類芽孢桿菌HD-1（Paenibacillus polymyxa HD-1） 武漢生物工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室分離保藏；硫酸鎂、磷酸二氫鉀、3，5—二硝基水楊酸（DNS）、氯化鈉、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）等均為分析純購(gòu)于天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心；瓊脂、酵母提取物、酵母膏、蛋白胨、酵母粉等均為生化試劑購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；麩皮和稻草粉購(gòu)于市場(chǎng)，粉碎并過(guò)80目篩。

pHS-3C酸度計(jì)上海雷磁儀器廠；SPX-250型生化培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；TU1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京譜析通儀器有限公司；LDZX-40B型立式自控電熱蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂20g、調(diào)節(jié)pH7.4，定容于1000mL蒸餾水中。

液體種子培養(yǎng)基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化鈉5g，調(diào)節(jié)pH7.4，定容于1000mL蒸餾水中。

基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC-Na 5g，蛋白胨10g，磷酸二氫鉀0.2g，硫酸鎂0.5g，調(diào)節(jié)pH8.0，定容于1000mL蒸餾水中。

1.3發(fā)酵方法

1.3.1斜面活化將保存的多粘類芽孢桿菌HD-1接種于斜面活化培養(yǎng)基上，35℃活化培養(yǎng)24h。

1.3.2液體種子制備取一環(huán)活化后的菌種HD-1，接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200r/min、35℃恒溫培養(yǎng)24h［14］。

1.3.3搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)以4%接種量將液體種子接入盛有50mL基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200r/min、35℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)48h。

1.4酶活測(cè)定

1.4.1粗酶液制備將培養(yǎng)了48h的發(fā)酵液5000r/min冷凍離心5min，取上清液即為粗酶液，4℃保存［7］。

1.4.2纖維素酶活性的測(cè)定以酶活為指標(biāo)，以CMC-Na為底物，采用DNS比色法測(cè)定發(fā)酵液中纖維素酶的活性。取0.9mL 1%的CMC-Na溶液，50℃水浴預(yù)熱5min，然后加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的粗酶液0.1mL，50℃準(zhǔn)確反應(yīng)30min，立即加入1mL DNS試劑，沸水浴顯色5min，冷卻后，測(cè)定540nm處吸光度值。空白對(duì)照先加DNS試劑后加粗酶液［8］。在上述條件下，每分鐘由底物釋放1μmol還原糖（用葡萄糖作對(duì)照）所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U/mL）［15］。

1.5培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.5.1碳源種類對(duì)發(fā)酵的影響將1.2的基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的碳源分別改變?yōu)镃MC、可溶性淀粉、蔗糖、稻草粉、麩皮、稻草粉+麩皮（質(zhì)量比4∶1），添加量均為0.5%，其他營(yíng)養(yǎng)成分參照基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基不變，按照1.3.3的方法進(jìn)行發(fā)酵，取樣測(cè)定酶活。

1.5.2碳源用量對(duì)發(fā)酵的影響最佳碳源種類確定后，改變碳源用量，分別設(shè)0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%共6個(gè)梯度，其他營(yíng)養(yǎng)成分參照基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基不變，按照1.3.3的方法進(jìn)行發(fā)酵，取樣測(cè)定酶活。

1.5.3氮源種類對(duì)發(fā)酵的影響將1.2的基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的氮源分別改變?yōu)榻湍父唷⒔湍阜?、蛋白胨、硫酸氨、硝酸氨和尿素，添加量均?%，其他營(yíng)養(yǎng)成分參照基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基不變，按照1.3.3的方法進(jìn)行發(fā)酵，取樣測(cè)定酶活。

1.5.4氮源用量對(duì)發(fā)酵的影響最佳氮源種類確定后，改變氮源用量，分別設(shè)0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%共6個(gè)梯度，其他營(yíng)養(yǎng)成分參照基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基不變，按照1.3.3的方法進(jìn)行發(fā)酵，取樣測(cè)定酶活。

1.5.5正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)［5，16］，取碳源、氮源、磷酸二氫鉀及硫酸鎂4個(gè)因素，每因素取3個(gè)水平，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。培養(yǎng)基優(yōu)化的因素水平見(jiàn)表1。

表1　培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1　Factors and levels of orthogonal test for medium

1.6培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.6.1培養(yǎng)基初始pH對(duì)發(fā)酵的影響調(diào)節(jié)基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，按照1.3.3的方法進(jìn)行發(fā)酵，取樣測(cè)定酶活。

1.6.2裝液量對(duì)發(fā)酵的影響250mL三角瓶分別裝入25、50、75、100mL的基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基，按照1.3.3的方法進(jìn)行發(fā)酵，取樣測(cè)定酶活。

1.6.3接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響分別以2%、4%、6%、8%、10%的接種量，接種于基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，按照1.3.3的方法進(jìn)行發(fā)酵，取樣測(cè)定酶活。

1.6.4溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響設(shè)定揺瓶培養(yǎng)溫度分別為28、30、33、35、37、40℃，按照1.3.3的方法進(jìn)行發(fā)酵，取樣測(cè)定酶活。

1.6.5揺瓶轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響分別設(shè)定160、180、200、220、240、260r/min的轉(zhuǎn)速，按照1.3.3的方法進(jìn)行發(fā)酵，取樣測(cè)定酶活。

1.6.6發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響按照1.3.3的方法進(jìn)行發(fā)酵，每隔6h取樣測(cè)定酶活。

1.6.7正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取溫度、初始pH、接種量及發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素，每因素取3個(gè)水平。培養(yǎng)條件優(yōu)化的因素水平見(jiàn)表2。

仆人來(lái)不及查看釣竿，就發(fā)現(xiàn)地上有一支小巧的銅笛，沾著鮮血。確切地講，那不是笛子，只不過(guò)模樣像笛子，小得多，也短得多。就是這玩意，剛才砰的一下從釣竿握把底端射出，貫通李霸崖身體，洞穿其肝臟。

表2　培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2　Factors and levels of orthogonal test for culture conditions

1.7數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理，采用Excel軟件進(jìn)行作圖，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，顯著性水平為p＜0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.1.1碳源種類對(duì)發(fā)酵的影響不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖1所示，多粘類芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的最適碳源為麩皮，當(dāng)以CMC為碳源時(shí)酶活較低，這可能是由于麩皮為植物性來(lái)源的材料，營(yíng)養(yǎng)成分更全，而CMC為單一成分的化學(xué)試劑，在培養(yǎng)基中會(huì)造成發(fā)酵液比較粘稠，影響溶氧。

圖1　不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1　Effect of carbon source on cellulase

2.1.2碳源用量對(duì)發(fā)酵的影響麩皮用量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖2所示，產(chǎn)纖維素酶的最適麩皮用量為0.5%，超過(guò)0.75%酶活力迅速下降，可能是因?yàn)辂熎げ蝗苡谂囵B(yǎng)基，濃度過(guò)大影響溶氧。

圖2　麩皮濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2　Effect of bran on cellulase

2.1.3氮源種類對(duì)發(fā)酵的影響不同氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖3所示，在不同的氮源種類中，有機(jī)氮營(yíng)養(yǎng)豐富，效果優(yōu)于無(wú)機(jī)氮，其中酵母膏對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)作用最大，因此多粘類芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的最適氮源為酵母膏。

2.1.4氮源用量對(duì)發(fā)酵的影響酵母膏用量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖4所示，酵母膏用量在0.25%～1%時(shí)，纖維素酶活力不斷升高，1%時(shí)最佳，超過(guò)1%酶活迅速下降，因?yàn)榈礉舛冗^(guò)高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞脫水死亡，不利于代謝產(chǎn)物的積累；而氮源不足，菌體繁殖速度太慢，影響酶的產(chǎn)量。

圖3　不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3　Effect of nitrogen source on cellulase

圖4　酵母膏濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4　Effect of yeast extract on cellulase

表3　培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table 3　Optimization results of orthogonal test for medium

表4　培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果方差分析Table 4　Variance analysis of orthogonal test

2.1.5培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果培養(yǎng)基成分正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

由表3可知，影響多粘類芽孢桿菌HD-1產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基成分因素由大到小順序?yàn)锳＞C＞D＞B，優(yōu)組合為A2B3C3D2，即麩皮0.5%、酵母膏1.25%、磷酸二氫鉀0.04%、硫酸鎂0.1%。對(duì)優(yōu)組合A2B3C3D2進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，纖維素酶活力可達(dá)84.3U/mL，高于正交表中的最大酶活81.5U/mL。由表4可知，因素A、C、B、D對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響極其顯著，各因素顯著程度為A＞C＞D＞B，與極差分析結(jié)果一致。

2.2培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1培養(yǎng)基初始pH對(duì)發(fā)酵的影響初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響不僅表現(xiàn)在改變基質(zhì)代謝速率，還表現(xiàn)在改變代謝途徑及細(xì)胞形態(tài)等方面。不同培養(yǎng)基初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖5所示，多粘類芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的最適初始pH為9。

圖5 初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5　Effect of initial pH on cellulase

2.2.2裝液量對(duì)發(fā)酵的影響不同裝液量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖6所示，裝液量主要影響發(fā)酵過(guò)程中的通氣情況從而影響產(chǎn)酶，裝液量過(guò)小導(dǎo)致培養(yǎng)基水分蒸發(fā)較快及代謝物濃度較大，溶氧下降；裝液量過(guò)大導(dǎo)致振蕩效果減弱，溶氧降低［16］。多粘類芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的搖瓶發(fā)酵最適裝液量為50mL。

圖6　裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6　Effect of medium volume on cellulase

2.2.3接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖7所示，多粘類芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的最適接種量為6%。接種量過(guò)小菌體數(shù)量不夠，接種量過(guò)大引起短時(shí)間內(nèi)菌體大量生長(zhǎng)繁殖，從而使溶氧不足，均不利于產(chǎn)酶。

2.2.4溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖8所示，多粘類芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的最適發(fā)酵溫度為33℃。在30～35℃酶活都較高，溫度過(guò)低不利于菌體生長(zhǎng)，溫度過(guò)高（＞35℃）菌體衰老、酶活迅速下降。

2.2.5搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖9所示，多粘類芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的最適轉(zhuǎn)速為220r/min。轉(zhuǎn)速太小影響通氣量從而影響溶氧，不利于產(chǎn)酶；轉(zhuǎn)速太大氣體停留時(shí)間縮短從而使得溶氧減低，同時(shí)剪切力過(guò)大，不利于產(chǎn)酶。

圖7　接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.7　Effect of inoculation volume on cellulase

圖8 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.8　Effect of temperature on cellulase

圖9　搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.9　Effect of agitation speed on cellulase

2.2.6發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖10所示，多粘類芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的最適發(fā)酵時(shí)間為48h。發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，微生物沒(méi)有充分生長(zhǎng)導(dǎo)致產(chǎn)酶較少，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)微生物發(fā)生自溶，不利于產(chǎn)酶。

2.2.7培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析見(jiàn)表6。由表5可知，影響多粘類芽孢桿菌HD-1產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件因素由大到小順序?yàn)镠＞F＞E＞G，即發(fā)酵時(shí)間＞培養(yǎng)基初始pH＞溫度＞接種量；優(yōu)組合為E3F2G1H3，即溫度35℃、初始pH8.0、接種量4%、發(fā)酵時(shí)間51h。由表6可知，因素E、F、G、H對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響均極顯著，且顯著程度為H＞F＞E＞G，與極差分析結(jié)果一致。

圖10　發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.10　Effect of culturing length on cellulase

表5　培養(yǎng)條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5　Optimization results of orthogonal test for culture conditions

表6　培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果方差分析Table 6　Variance analysis of orthogonal test

3　結(jié)論與討論

通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)多粘類芽孢桿菌HD-1的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到其產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為麩皮0.5%、酵母膏1.25%、磷酸二氫鉀0.04%、硫酸鎂0.1%、培養(yǎng)基初始pH8.0，培養(yǎng)溫度35℃、接種量4%、發(fā)酵時(shí)間51h。在此條件下，纖維素酶活力可達(dá)88.3U/mL。另外，從兩個(gè)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析可以看出，麩皮用量、磷酸二氫鉀用量及發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)產(chǎn)酶影響極大，應(yīng)嚴(yán)格控制以利于產(chǎn)酶。本實(shí)驗(yàn)首次研究了多粘類芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵工藝，為多粘類芽孢桿菌后續(xù)的深度開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論支持。目前由于菌種及發(fā)酵工藝的原因，其產(chǎn)生的纖維素酶活性并不太理想，還需進(jìn)一步研究。多粘類芽孢桿菌HD-1產(chǎn)生的纖維素酶可用于飼料添加劑、造紙及洗滌工業(yè)中［3］，在以后可研究合適的發(fā)酵條件，使得發(fā)酵后的多粘類芽孢桿菌菌體用于微生態(tài)制劑［11］，發(fā)酵上清用于酶制劑生產(chǎn)［16］。

［1］趙琪，李亞蘭，陳子欣，等.纖維素酶應(yīng)用研究的最新進(jìn)展［J］.廣州化工，2014，42（6）：21-23.

［2］楊盛，侯紅萍.纖維素酶及其研究進(jìn)展［J］.中國(guó)調(diào)味品，2008（11）：27-30.

［3］熊立根，柴士名，李旺，等.纖維素酶及其應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.江西飼料，2008（4）：23-27.

［4］王萬(wàn)能，張瀟駿，呂婧，等.R2工程細(xì)菌纖維素酶酶活影響條件初探［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（18）：4486-4489.

［5］劉建國(guó)，韓梅.一株低溫產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選及其發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵科技，2014，50（1）：38-41.

［6］蘆志龍，張穗生，吳仁智，等.產(chǎn)纖維素酶新菌株的篩選及其產(chǎn)酶特性研究［J］.廣西科學(xué)，2014，21（1）：22-27.

［7］孟威.纖維素酶產(chǎn)生菌的誘變育種及發(fā)酵工藝的研究［D］.長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2008.

［8］祝小，王振華，潘康成，等.產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌篩選及發(fā)酵條件的初步研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2006（11）：122-124.

［9］CHOONG-MIN R，JINWOOK，OKHEEC，et al.Improvement of biological control capaeity of Paenibacillus polymyxa E681 by seed pelleting on sesame［J］.Biological Control，2006，39（3）：282-289.

［10］韓俊華，陳大歡，黃繼翔.響應(yīng)面法優(yōu)化多粘類芽孢桿菌HT16產(chǎn)生抗菌蛋白的培養(yǎng)基［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（13）：262-266.

［11］楊少波，劉訓(xùn)理.多粘類芽孢桿菌及其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（10）：1621-1625.

［12］Li B，Yu R R，Tang Q M，et al.Biofilm formation ability of PaenibacilluspoiymyxaandPaenibacillusmaceranstheir inhibitory effect against tomato bacterial wilt［J］.African Journal of Microbiology Research，2011，5（25）：4260-4266．

［13］Choi S K，Park S Y，Kim R，et al.Identification of a Polymyxin synthetase gene cluster of Paenibacillus polymyxa and heterologous expression of the gene in Bacillus subtilis［J］. Journal of Bacteriology，2009，191（10）：3350-3358．

［14］王旭愿，張敏，李成濤，等.洋蔥假單胞菌產(chǎn)脂肪酶條件的優(yōu)化［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（1）：184-187.

［15］江國(guó)忠.高產(chǎn)纖維素酶枯草芽孢桿菌的篩選、應(yīng)用及其產(chǎn)酶條件研究［D］.南昌：南昌大學(xué)，2010.

［16］蔣紅菊，許威震，朱春林，等.多粘類芽孢桿菌20185液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)堿性果膠酶發(fā)酵條件的研究［J］.中國(guó)釀造，2011（10）：111-114.

Optimization of producing conditions of the cellulase from Paenibacillus polymyxa HD-1

CHENG Ai-fang，DENG Zheng-dong*，CHEN Wen，ZHOU Nian-bo，HUANG Fang-yi
（School of Life Science and Technology，Wuhan Institute of Bioengineering，Wuhan 430415，China）

In order to improve the production of cellulase，the fermentation medium and culture conditions for Paenibacillus polymyxa HD-1 were optimized by single factor test and orthogonal test.The results showed that the best compositions of fermentation medium were 0.5%of bran，1.25%of yeast extract，0.04%of KH2PO4·3H2O，0.1%of MgSO4·7H2O，with the initial pH of the medium was 8.0；and the best fermentation inoculum size was 4%，culture temperature at 35℃ and culture time for 51 hours.Under this optimal conditions，the activity of cellulase from Paenibacillus polymyxa HD-1 could reach 88.3U/mL.

Paenibacillus polymyxa HD-1；cellulase；fermentation conditions；optimization

TS202.3

A

1002-0306（2015）10-0173-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.027

2014－08－18

程愛(ài)芳（1980-），女，碩士，講師，研究方向：食品生物技術(shù)及微生物發(fā)酵。

鄧政東（1973-），男，碩士，講師，研究方向：微生物發(fā)酵及產(chǎn)物提取。

武漢生物工程學(xué)院校級(jí)研究項(xiàng)目（2013JYI01）。