楊建香

（桂林師范高等?？茖W(xué)校，廣西 桂林 541001）

南海紅樹林內(nèi)生真菌Sk-3代謝產(chǎn)物研究

楊建香

（桂林師范高等專科學(xué)校，廣西 桂林 541001）

研究南海紅樹林內(nèi)生真菌Sk-3的代謝產(chǎn)物，采用反復(fù)硅膠柱色譜法、Sephadex LH-20凝膠色譜法等進(jìn)行分離純化，并通過理化常數(shù)測定和光譜分析鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。從南海紅樹林內(nèi)生真菌Sk-3的菌體中分離得到4個(gè)代謝產(chǎn)物。經(jīng)波譜解析，分別為3-（羥甲基）-6，8-二甲氧基香豆素（1），4-（Hydroxymethyl）-7-methoxy-6-methyl-1（3H）-isobenzofuranone（2），環(huán)（苯丙-苯丙）二肽（3），環(huán)（苯丙-酪）肽（4）。所有化合物均首次從南海紅樹林內(nèi)生真菌Sk-3中分離得到。

紅樹林；內(nèi)生真菌；代謝產(chǎn)物

人類生存在一個(gè)被海洋覆蓋的星球， 海洋占地球總面積的71%， 全部水源的97%都在海洋之中［1］，海洋中蘊(yùn)藏著約5億種生物， 是人類豐富的藥源生物資源。海洋微生物生存環(huán)境迥異于陸地環(huán)境，如高鹽、高壓、低溫、寡營養(yǎng)等，在此環(huán)境下存活的海洋微生物具有獨(dú)特的代謝途徑和機(jī)體防御機(jī)制，其產(chǎn)生的代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有極大的復(fù)雜性和多樣性。這就為從海洋微生物及其代謝產(chǎn)物中篩選和提取具有特異化 學(xué)結(jié)構(gòu)的天然活性物質(zhì)提供了極大的可能性。

本文對(duì)南海紅樹林內(nèi)生真菌Sk-3代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，從菌體中分離得到4個(gè)化合物：3-（羥甲基）-6，8-二甲氧基香豆素 （1），4-（hdroxymethyl） -7-methoxy-6-methyl-1（3H）-isobenzofuranone（2），環(huán)（苯丙-苯丙）二肽（3），環(huán)（苯丙-酪）肽（4）。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

INOVA-500NB超導(dǎo)核磁共振譜儀和INOVA-500NB核磁共振儀，VG ZAB-HS雙聚焦質(zhì)譜儀，Thermo DSQ電子轟擊電離質(zhì)譜儀，Thermo MAT95XP高分辨質(zhì)譜儀，X-4數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測定儀。

所用試劑均為化學(xué)純，溶劑重蒸后使用。柱層析硅膠為0.038～0.045mm硅膠，硅膠H，薄層硅膠GF254。

1.2 菌種培養(yǎng)

紅樹林內(nèi)生真菌Sk-3采自中國山口，經(jīng)鑒定為擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis sp.），發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖10g·L-1，蛋白胨2g·L-1，酵母膏1g·L-1，粗海鹽2g·L-1，pH 7.5。500mL三角瓶內(nèi)裝培養(yǎng)基300mL，1.25×105Pa滅菌25min后接種150L，在25℃靜置培養(yǎng)35d。分別收集發(fā)酵液和菌體。

1.3 提取與分離

150L發(fā)酵物過濾得菌體和發(fā)酵液，發(fā)酵液濃縮后用乙酸乙酯充分萃取，菌體用甲醇多次浸泡。提取濃縮物分別以體積比1∶2拌硅膠（0.038～0.048mm）進(jìn)行柱層析，以石油醚/乙酸乙酯/甲醇進(jìn)行梯度加壓洗脫。收集各組分再經(jīng)反復(fù)柱層析，制備薄層層析、重結(jié)晶等方法進(jìn)行分離純化。從菌體粗提物（約45g）分離得到化合物1 （8mg），2 （10mg），3 （10mg），4 （13mg） 。

1.4 化合物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

化合物1：淡黃色晶體，mp：179～181℃。1H NMR（Acetone-d6，300Hz） δ：7.86 （1H，t，J=2.0Hz），6.78（1H，d，J=3.0Hz），6.79（1H，d，J=3.0Hz），4.52（2H，dd，J=5.5，2.0Hz），4.44（OH，d，J=5.5Hz），3.86（3H，s），3.95（3H，s）。13C NMR spectrum （Acetone-d6，75 MHz） δ：160.6（C），157.4（C），148.9（C），138.4（C），137.9（CH），130.9（C），120.9（C），103.2（CH），101.6（CH），59.8（CH2），56.5（CH3），56.2（CH3）。Mass spectrum （EI，70eV，m/z，Irel，%）：236（100.0），207（22.5），193（4.4），191（17.5），179（7.5），166（6.3），137（6.3），133（5.3）。分子式C12H12O5。

化合物2：黃色粉末，mp：264～265℃。1H NMR spectrum （Acetone-d6，400 MHz）：2.29（3H，s），2.60（1H，br），3.98（3H，s），4.68（2H，s），5.33（2H，s），7.48（1H，s）。13C NMR spectrum （Acetone-d6，125MHz）：170.3（C），158.0（C），147.2（C），137.2（CH），133.3（C），132.9（C），118.8（C），70.2（CH2），63.3（CH3），62.9（CH2），16.5（CH3）。

化合物3：白色針晶，mp：120～122℃。1HNMR（DMSO-d6， 300 MHz）δ：7.90（s，1H，NH），7.28（dd，7.5，7.0Hz，2H），7.23（dd，7.5，7.0Hz，1H），7.11（d，7.5Hz，2H），4.05（m，1H），2.92（dd，13.5，7.5Hz，1H），2.23（dd，13.5，7.5Hz，1H）。FABMS（m/z）：295 ［M+H］+，279，156，120，89，77，51。

化合物4：白色固體，mp：291～293℃。EIMS （m/z）：310［M］+。1H NMR （DMSO-d6，300 MHz）δ：9.06（1H，s），7.65（2H，brs），7.28 （2H，t，J=7.5Hz），7.20（1H， t，J=7.5Hz），7.06（2H，d，J=7.0Hz），6.86（2H，d，J=8.5Hz），6.68（2H，d，J=8.5Hz），3.96（1H，m），3.88（1H，m），2.63（2H，dd，J=14.0，7.0Hz），2.24（2H，dd，J=14.0，7.0Hz）。13C NMR （DMSO-d6，75MHz） δ：165.9，165.8，155.8，136.5，130.6，129.6，127.9，126.4，114.8，55.7，55.5，39.2，38.9。

2 結(jié)果與討論

化合物1：EIMS顯示分子離子峰236，可知分子式為C12H12O5。1HNMR顯示該化合物有2個(gè)間位的苯環(huán)氫［δH6.78（1H，d，J=3.0），6.79（1H，d，J=3.0）］、1個(gè)雙鍵氫［δH7.86 （1H，t，J=2.0）］、1個(gè)連在不飽和碳上的CH2［δH4.52 （1H，dd，J=5.5，2.0）］，1個(gè)活潑氫［δH4.44（1H，d，J=5.5）］，2個(gè)連在芳香環(huán)上的甲氧基［δH3.86 （3H，s），3.95 （3H，s）］。13C NMR顯示該化合物有1個(gè)香豆素的骨架。2DNMR并與文獻(xiàn)對(duì)照后確定化合物的結(jié)構(gòu)為3-（hydroxymethyl）-6，8-dimthoxy-2H-chromen-2-one［2］。

化合物2：由NMR數(shù)據(jù)，以及HR-EIMS譜中分子離子峰為208.0723［M］+（計(jì)算值208.0730），確定分子式為C11H12O4，不飽和度U=6。13CNMR 和DEPT顯示分子中有2個(gè)CH3，2個(gè)CH2，1個(gè)CH，CH（δ 7.48，s）說明是苯環(huán)上的H，CH2（δ 5.33，s）和CH2（δ 4.68，s）以及CH3（δ 3.98，s）說明它們都與氧原子相連。δ 170.3（C）可能為酯基。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［3］對(duì)照基本一致。

化合物3：白色針狀晶體，溶解性能很差，TLC碘熏顯白點(diǎn)，拖尾，熔點(diǎn)＞290℃。FABMS給出295［M+H］+，結(jié)合氫譜提示分子式為C18H18N2O2，不飽和度為11。IR譜提示存在活潑氫信號(hào)［ν3190（brs）cm-1］和羰基信號(hào)（ν1660cm-1）。氫譜共給出9個(gè)質(zhì)子信號(hào)，說明化合物是對(duì)稱的。從氫譜7.28（dd，7.5，7.0Hz，2H）、7.23（dd，7.5，7.0Hz，1H）、7.11（d，7.5Hz，2H）看出化合物存在一個(gè)單取代苯環(huán)，δ4.05（m，1H）是連雜原子的飽和次甲基質(zhì)子信號(hào)，δ2.23（dd，13.5，7.5Hz，1H）和2.92（dd，13.5，7.5Hz，1H）是芐亞甲基質(zhì)子的特征，δ7.90（brs，1H）是活潑NH信號(hào)，據(jù)此推出該化合物為環(huán)（苯丙-苯丙）二肽。進(jìn)一步與文獻(xiàn)［4］對(duì)比得到確證。

化合物4：白色固體，EI-MS顯示其分子量為310，結(jié)合NMR分析得出化合物的分子式為C18H18N2O3。通過1H NMR（DMSO，TMS），δ 7.28 （2H，t，J=7.5Hz），δ7.20 （1H， t， J=7.5Hz），δ7.06 （2H， d，J=7.0Hz）推斷有一個(gè)單取代的苯環(huán)，δ 7.65 （2H， brs）為2個(gè)活潑氫， δ 3.96 （1H， m）和δ 3.88 （1H，m）為和雜原子相連的氫，δ 6.86 （2H， d， J=8.5Hz）和δ 6.68 （2H，d， J=8.5Hz）暗示還有4個(gè)對(duì)位取代的苯環(huán)上的氫，δ 9.06（1H， s）可能為酚羥基。13C NMR中δ 165.9初步可以證實(shí)是酰胺中的羰基信號(hào)，δ 130.6、129.6、127.9、114.8也進(jìn)一步證實(shí)了分子中苯環(huán)的存在，與1H NMR分析得出化合物中有一個(gè)單取代苯環(huán)和一個(gè)對(duì)位二取代苯環(huán)相一致。對(duì)照文獻(xiàn)［5］，確定化合物4為環(huán)（苯丙-酪）肽。

［1］ Barnes RSK， Hughes RN. An Introduction to MarineEcology［M］. Chichester， UK： Wiley-Blackwell， 1999： 1-3.

［2］ Ayer WA & Racok JS. The metabolites of Talaromyces flavus. Part 1. Metabolites of the organic extracts［J］. Can. J. Chem.， 1990， 68 （11）： 2085-2094.

［3］ Y.S.Tsantrizos， K. K. Ogilvie， A.K.Watson. Phytotoxic metabolites of Phomop-sis convolvulus， a host-specific pathogenof field bindweed［J］. Can. I. Chem.， 1992（70）： 2276-2284.

［4］ Abell C， Garson M J， Leeper F J， Staunton J. Biosynthsis of the fungal metabolites alternariol， mellein， rubrofusarin，and 6-methylsalcylic acid from CD3CO2H［J］. J. Chem. Soc.，Chem. Commun.， 1982： 1011-1013.

［5］ 王雙明， 譚寧華， 楊亞濱，等. 三七環(huán)二肽成分［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2004，16（5）：383-386.

Metabolites of Mangrove Endophytic Fungus Sk-3 from South China Sea

YANG Jian-xiang
(Department of Editorial, Guilin Normal College, Guilin 541002, China)

Secondary metabolites of mangrove endophytic fungus No. Sk-3 from the south China sea was studied. The compounds were isolated by column chromatography and identifi ed on the basia of physic-chemical constants and spectral analysis. Four metabolites were obtained and elucidated: 3-(hydroxymethyl)-6,8-dimthoxy-2H-chromen-2-one (1), 4-(Hydroxymethyl) -7- methoxy- 6-methyl-1(3H)-isobenzofuranone(2), [cyclo-(Phe-phe) (3), cy lo ( Phe -Tyr) (4). The four metabolites were obtained from endophytic fungus No. Sk-3 for the fi rst time.

mangrove; endophytic fungus; metabolites

O 629

A

1671-9905（2015）10-0010-03

廣西教育廳科研項(xiàng)目（KY2015LX598）

楊建香（1979-），女，漢族，博士，教授，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail： 791011@126.com，電話：18978660936

2015-08-14