王志元丁博曾廣豐韋曉群陳文銳*

（1.廣東出入境檢驗檢疫局 廣東廣州 510623；2.廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點實驗室）

LC-Q-TOF-MS法測定嬰幼兒奶粉中5種核苷含量

王志元1,2丁博1,2曾廣豐1,2韋曉群1,2陳文銳1,2*

（1.廣東出入境檢驗檢疫局 廣東廣州 510623；2.廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點實驗室）

建立LC-Q-TOF-MS高分辨質(zhì)譜技術(shù)快速篩查分析嬰幼兒奶粉中鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷和次黃嘌呤核苷等5種核苷含量的方法。利用丙酮、氯仿、乙酸鋅與亞鐵氰化鉀、乙腈/0.1%三氟乙酸、乙腈/0.5%甲酸等不同蛋白質(zhì)沉淀方法處理奶粉中蛋白質(zhì)，離心、過濾除去大分子物質(zhì)；中高壓液相色譜分析，一級TOF-MS和二級IDA-MS高分辨質(zhì)譜模式進(jìn)行檢測，外標(biāo)法定量分析。結(jié)果表明，氯仿蛋白沉淀法最佳，核苷在5 min內(nèi)達(dá)到基線分離，5-200 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系好，相關(guān)系數(shù)r達(dá)到0.999，5種核苷分析方法檢出限為0.3-3 μg/L。本方法操作簡單、準(zhǔn)確，可快速定性和定量分析嬰幼兒奶粉中核苷的含量。

LC-Q-TOF-MS；核苷；高分辨質(zhì)譜；奶粉

1 前言

國際生命科學(xué)學(xué)會研究表明核苷酸具有提高人體免疫力、促使細(xì)胞再生與修復(fù)等生理功能，對人體生長發(fā)育有一定促進(jìn)作用［1］。核苷酸包括嘌呤和嘧啶兩類核苷酸化合物，它們在細(xì)胞中物質(zhì)生化合成、能量供給、DNA和RNA合成和必需輔酶產(chǎn)生等一般生理代謝中起著關(guān)鍵作用，并且具有不同能量消耗、能量保存與物質(zhì)補(bǔ)償途徑，嘌呤核苷酸主要從核苷堿基獲得補(bǔ)充，嘧啶核苷酸主要是從核苷獲得補(bǔ)償［2，3］。由此可見，核苷酸及核苷被認(rèn)為是一類重要的功能食品有效因子成分，在膳食補(bǔ)劑食品奶粉中添加核苷酸及核苷已成為國際共識。近十年來，我國國內(nèi)市場嬰幼兒奶粉食品安全問題頻繁發(fā)生，比如三聚氰胺事件，因此檢測分析嬰幼兒奶粉中核苷的研究工作，對食品奶粉質(zhì)量安全有著重要作用與意義。

奶粉中核苷測定主要涉及蛋白質(zhì)沉淀前處理問題，文獻(xiàn)報道蛋白質(zhì)沉淀方法有甲醇及甲醇與水方法［4，5］、三氯乙酸方法［6］、甲醇與氯仿方法［7］、乙腈及乙腈與甲酸方法［8］和丙酮方法［9］，不同蛋白質(zhì)沉淀方法對核苷測量結(jié)果影響不同。為此本研究選擇氯仿、丙酮、乙酸鋅與亞鐵氰化鉀、乙腈與0.1%三氟乙酸或0.5%甲酸等沉淀蛋白質(zhì)方法，考察它們對核苷含量測定的影響。

目前，核苷酸及核苷的儀器測定法包括液相色譜法［10，11］、毛細(xì)管電泳法［12］、液相色譜-質(zhì)譜方法［7，13，14］等。其中液相色譜-質(zhì)譜法是常用的核苷酸及核苷分析方法，該分析方法具有基質(zhì)干擾少、操作簡單、重現(xiàn)性好等特點。因此，本研究選擇LC-Q-TOF-MS分析方法，高分辨質(zhì)譜技術(shù)定性定量分析奶粉中核苷的含量。本方法快速、靈敏準(zhǔn)確，適應(yīng)于復(fù)雜基質(zhì)奶粉樣品的分析。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1儀器

Triple TOF?5600+高分辨質(zhì)譜儀：美國ABsciex公司；HPLC 20AD高效液相色譜儀：日本島津公司；Atlantis?T3色譜柱（100 mm×3 mm，3 μm）：美國Waters公司；氮吹濃縮儀（Turbo Vap@LV：瑞典Biotage公司；T25高速均質(zhì)機(jī)、VORTEX 4旋渦混勻器：德國IKA公司；4k-15離心機(jī)：美國Sigma公司；Milli-Q超純水裝置：美國Millipore公司。

2.1.2試劑

5種核苷標(biāo)準(zhǔn)品（腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷和次黃嘌呤核苷）：購于德國Dr Ehrestorfer公司；乙腈、甲醇：色譜純，美國賽默飛世爾科技公司；三氟乙酸、甲酸、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀和丙酮：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。所有用水均為純水機(jī)產(chǎn)生的超純水（電阻值18.2MΩ·cm）。

2.2方法

2.2.1儀器工作條件

2.2.1.1色譜條件

色譜柱：Atlantis?T3色譜柱（100 mm×3 mm，3 μm）；進(jìn)樣體積：5 μL；流速0.5 mL/min；柱溫：40℃；梯度洗脫條件：流動相A-0.1%甲酸-5mM甲酸銨水溶液，流動相B-乙腈；初始2%B相5 min升至10%，保留2 min，0.1 min降至2%，保留2.9 min。

2.2.1.2質(zhì)譜條件

離子源：ESI和APCI復(fù)合源；正離子掃描方式；APCI源連接ABsciex公司自動校正系統(tǒng)（CDS），每10個樣品自動校正1次；APCI正離子校正液流速：0.3 mL/min；Curtain gas：40 psi；離子源gas 1：50 psi；離子源gas 2：50 psi；離子源溫度：500℃；離子源電壓：5500 V。一級TOF-MS掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍：100-1000 Da；數(shù)據(jù)采集時間：100 ms；DP：100 V；CE：10 V。二級IDA-MS掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍：50-1000 Da；DP：100V；CE：35±15V；高靈敏模式；數(shù)據(jù)采集時間：50 ms；信號閾值：100 cps；IDA實驗每循環(huán)采集6次數(shù)據(jù)，動態(tài)背景減法扣除。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用超純水分別配制腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷和次黃嘌呤核苷等5種核苷標(biāo)準(zhǔn)儲備液（質(zhì)量濃度為1 mg/mL），根據(jù)需要配制系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.2.3樣品前處理

準(zhǔn)確稱量5.000 g嬰幼兒奶粉，用30 mL溫水溶解，超聲振蕩10 min，定容至50 mL刻度管；分別取2 mL溶液各分別加入2 mL氯仿、丙酮、乙酸鋅與亞鐵氰化鉀、乙腈/0.1%三氟乙酸和乙腈/0.5%甲酸等不同沉淀劑，渦旋、離心，轉(zhuǎn)移上清液至25 mL刻度管，加入純凈水定容，取1 mL溶液過0.22 μm濾膜，直接進(jìn)樣分析。

2.2.4數(shù)據(jù)分析方法

高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)在ABSciex公司的Analyst TF 1.6軟件采集，質(zhì)譜數(shù)據(jù)在PeakView2.0，MasterView 2.0和MultiQuant 3.0等軟件上定性定量處理分析。

3 結(jié)果與討論

3.1LC-Q-TOF-MS液質(zhì)數(shù)據(jù)參數(shù)

在ABSciex triple TOF 5600+高分辨質(zhì)譜儀上獲得每種核苷的一級TOF-MS和二級IDA-MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確分子量、同位素分子量和準(zhǔn)確碎片分子量等質(zhì)譜數(shù)據(jù)用來定性分析；根據(jù)一級TOF-MS準(zhǔn)確分子量對應(yīng)離子流色譜信號強(qiáng)度定量分析。5種核苷提取離子流色譜圖見圖1，高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1。

PeakView 2.0軟件配制質(zhì)量誤差、同位素比值差異、二級碎片數(shù)據(jù)庫評分和分子式搜索評分四種功能。當(dāng)準(zhǔn)確分子量誤差小于5 ppm，同位素比值差異小于10%，二級碎片數(shù)據(jù)庫評分大于70%和分子式搜索評分大于70%時，可確定待測物質(zhì)是目標(biāo)核苷物質(zhì)。

3.2樣品前處理方法的優(yōu)化

3.2.1沉淀方法的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報道和本實驗室常用的氯仿和乙酸鋅與亞鐵氰化鉀兩種蛋白質(zhì)沉淀方法，本研究設(shè)計選擇氯仿、丙酮、乙酸鋅與亞鐵氰化鉀、乙腈/0.1%三氟乙酸和乙腈/0.5%甲酸等5種蛋白質(zhì)沉淀方法處理嬰幼兒奶粉中蛋白質(zhì)，結(jié)果見表2。

圖1　5種核苷的離子流色譜圖

表1　5種核苷高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)

表2　不同蛋白質(zhì)沉淀方法的核苷提取量

試驗結(jié)果顯示，用氯仿、乙腈與0.1%三氟乙酸、丙酮沉淀奶粉中蛋白質(zhì)，5種核苷提取含量較好，乙酸鋅與亞鐵氰化鉀沉淀蛋白質(zhì)時，核苷的提取含量最低。結(jié)合沉淀溶劑對液相色譜與質(zhì)譜儀器的影響，以及沉淀溶劑與水的溶解性，本研究選擇氯仿蛋白質(zhì)沉底方法作為奶粉中蛋白質(zhì)前處理方法。

3.2.2沉淀劑氯仿用量

2 mL奶粉溫水溶液分別加入1、2和4 mL氯仿沉淀除去其中蛋白質(zhì)，測量嬰幼兒奶粉中核苷含量，結(jié)果見表3。

表3　不同蛋白質(zhì)沉淀方法的核苷提取量

試驗結(jié)果顯示，不同蛋白質(zhì)沉淀劑氯仿用量對奶粉中核苷測量呈現(xiàn)較顯著的差異，氯仿為1∶2時，核苷提取含量較高。因此，試驗選擇氯仿與奶粉體積比為1∶2作為蛋白質(zhì)沉淀劑氯仿的用量。

3.3方法的檢出限、定量限、線性范圍和加標(biāo)回收率

5種核苷混合標(biāo)準(zhǔn)液按照色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，得到每種物質(zhì)LC-Q-TOF-MS儀器方法的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限，結(jié)果見表4。

表4　核苷的檢出限、定量限與線性范圍

另外，為了考察氯仿沉淀蛋白質(zhì)的前處理方法與LC-Q-TOF-MS儀器方法，試驗選擇7.5mg/kg和 15 mg/kg濃度的核苷混合溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗驗證，結(jié)果見表5。

表5　回收率實驗結(jié)果

結(jié)果顯示，利用本方法測定5種核苷的含量，加標(biāo)回收率在84.0%-102%之間，表明氯仿沉淀奶粉中蛋白質(zhì)前處理方法與LC-Q-TOF-MS分析方法可以用來測定嬰幼兒奶粉中核苷的含量。

3.4實際樣品測定

選擇廣東檢驗檢疫技術(shù)中心食品實驗室日常檢測的10種奶粉樣品，利用本分析方法測定其中核苷的含量，結(jié)果見表6。

表6　實際樣品測定結(jié)果

結(jié)果顯示，不同奶粉樣品中核苷含量差異比較顯著，其中胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷的含量較高。

4 結(jié)論

本研究建立氯仿沉淀蛋白質(zhì)前處理技術(shù)與LCQ-TOF-MS分析方法測定膳食補(bǔ)劑嬰幼兒奶粉中核苷的含量，5種核苷的分析方法加標(biāo)回收率在84%-102%之間；方法簡單、準(zhǔn)確，可用于嬰幼兒奶參考文獻(xiàn)

粉乳粉中核苷的含量測定。

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Determination of Five Kinds of Nucleosides in Infant Formula by LC-Q-TOF-MS

Wang Zhiyuan1,2，Ding Bo1,2，Zeng Guangfeng1,2，Wei Xiaoqun1,2，Chen Wenrui1,2*
（1.Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou，Guangdong，510623；2.Guangdong Key Laboratory of Import and Export Technical Measures of Animal，Plant and Food）

It was established for the determination of adenosine,guanosine,cytidine,uridine and inosine in the infant formula by LC-Q-TOF-MS.The sample were dissolved in water and pretreated by adding acetone,chloroform,zinc acetate and potassium ferrocyanide,acetonitrile with 0.1%trifluoroacetic acid andacetonitrilewith0.5%aceticacidtoprecipitatetheproteins,respectively.Thesampleswere centrifuged with ultrafiltration centrifugal tube before injection into the chromatographic system,which were monitored in the TOF-MS and IDA-MS mode.The result showed that adding chloroform to precipitate the proteins was the better pretreatment method.The concentration of nucleosides in the range of 5-200 μg/L was linearly correlated to the peak area,with correlation coefficients greater than 0.999, and limit of detection 0.3-3 μg/L.It was a simple,quick and accurate analytical method for the detection of nucleosides in the infant formula.

LC-Q-TOF-MS；Nucleosides；High Resolution Mass Spectrometry；Infant Formula

O657.63

E-mail：wzyciq@163.com；*通訊作者E-mail：chenciq119@163.com

廣州市科技計劃項目（KHYZ2013B17）；廣東出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（GD2013K48）

2015-05-27