曹玉萍 沈永年 呂桂霞 王 樂 曾 榮 張孟麗 李玲珺 馬鵬程劉維達(dá)

·論著·

糠秕馬拉色菌皮膚感染模型的構(gòu)建

曹玉萍 沈永年 呂桂霞 王 樂 曾 榮 張孟麗 李玲珺 馬鵬程?劉維達(dá)?

目的： 構(gòu)建糠秕馬拉色菌的體外組織工程皮膚感染模型。方法： 利用成纖維細(xì)胞及牛膠原混合液構(gòu)建組織工程真皮，采用氣液界面培養(yǎng)方法在組織工程真皮表面培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞；糠秕馬拉色菌懸液感染組織工程皮膚，在不同時間點，利用HE染色及PAS染色觀察組織工程結(jié)構(gòu)的改變及糠秕馬拉色菌侵入深度的變化。結(jié)果： 構(gòu)建的組織工程皮膚結(jié)構(gòu)緊密，分化層數(shù)達(dá)8～10層。隨著糠秕馬拉色菌感染時間的延長，組織工程皮膚的基本結(jié)構(gòu)不被該菌破壞，芽生孢子密度隨著時間延長而增加，對于組織工程皮膚的侵襲僅限于表皮淺層。結(jié)論： 糠秕馬拉色菌的組織工程皮膚感染模型可較好的代表糠秕馬拉色菌在體感染情況，是馬拉色菌相關(guān)疾病較好的體外研究工具。

糠秕馬拉色菌； 組織工程

馬拉色菌是皮膚真菌感染性疾病最常見的病原菌之一，作為一種角層寄生真菌，它與花斑糠疹、馬拉色菌毛囊炎、頭皮糠疹、脂溢性皮炎、特應(yīng)性皮炎、銀屑病及融合性網(wǎng)狀乳頭瘤病等疾病的發(fā)病有關(guān)。在這些疾病中，有的即使菌含量很高，仍很少發(fā)生炎癥反應(yīng)（如花斑糠疹），有些則有明顯的炎癥反應(yīng)（如馬拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、銀屑病等）。關(guān)于馬拉色菌致病機制的假說很多，但均未經(jīng)證實。主要是由于此種真菌體外培養(yǎng)不易，需要特殊含油的培養(yǎng)基，目前尚無理想的體外模型。1，2有學(xué)者將臨床分離株與人外周血單核細(xì)胞（PBMC）共同培養(yǎng)研究其與宿主共存的模式；5，6此外，為了研究馬拉色菌在花斑糠疹中的致病機制，將臨床分離株與人角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)，以及其共培養(yǎng)液對黑素細(xì)胞的影響，7-9這些研究范圍較小，研究結(jié)論仍存在爭議，且單獨的細(xì)胞液下培養(yǎng)模型對在體皮膚的代表性仍存在一定差距，尋找理想的體外模型研究馬拉色菌的致病機制成為許多科學(xué)家努力的方向?？凤躐R拉色菌是臨床馬拉色菌相關(guān)疾病中分離率較高的菌種，為了對馬拉色菌的致病過程有更深入的了解，本研究利用糠秕馬拉色菌感染組織工程皮膚，擬在體外構(gòu)建糠秕馬拉色菌感染模型，為今后馬拉色菌發(fā)病機制的研究提供一個有利的工具。

1　材料和方法

1.1細(xì)胞及菌株來源 正常人原代角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞及成纖維細(xì)胞來源于5～25歲正常男性常規(guī)包皮環(huán)切術(shù)后的包皮（南京鼓樓醫(yī)院泌尿外科和南京市第一醫(yī)院泌尿科提供）?？凤躐R拉色菌（CBS1878）由衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)微生物菌（毒）種保藏管理中心真菌中心［簡稱CMCC（F）］提供。

1.2試劑和儀器 角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基為DK-SFM（Invitrogen公司），黑素細(xì)胞培養(yǎng)基為 M254，加入HMGS（Invitrogen公司），成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM完全培養(yǎng)基（Invitrogen公司），牛I型膠原溶液（Sigma公司），糠秕馬拉色菌培養(yǎng)基為Leeming和Notman培養(yǎng)基（MLNA），倒置顯微鏡（Olympus公司），CO2孵箱（Thermo公司），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精密科學(xué)儀器有限公司），Transwell 12孔板購自Corning公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 角質(zhì)形成細(xì)胞分離與培養(yǎng)及成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)參見文獻(xiàn)，3黑素細(xì)胞的培養(yǎng)參見文獻(xiàn)4

1.4含色素的組織工程皮膚的培養(yǎng) 在前期研究培養(yǎng)方法4進(jìn)行改進(jìn)。將4×105mL/L成纖維細(xì)胞重懸于牛膠原混合液中，取2 mL/孔至12孔板中，放置于37℃，5%CO2下孵育至完全凝固，向其中加入1.5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3天得組織工程真皮。向真皮表面滴加0.45 m L含4.5×104個黑素細(xì)胞和9×104個角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞懸液，置于37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)2天，第5天進(jìn)行氣液界面培養(yǎng)，第15天結(jié)束培養(yǎng)。

1.5糠秕馬拉色菌懸液制備 取新形成的成熟糠秕馬拉色菌菌落，將菌落置于盛有1 m L生理鹽水的碾磨器中，充分碾磨均勻。用生理鹽水將其濃度調(diào)整至1個麥?zhǔn)蠞舛龋?06個孢子m L/L）。

1.6糠秕馬拉色菌感染的組織工程皮膚模型的構(gòu)建取5μL糠秕馬拉色菌懸液滴加于Transwell小室內(nèi)含色素的組織工程皮膚表面，向下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基及50μL的無菌橄欖油，置于35℃ 5%CO2培養(yǎng)；于12 h、24 h、48 h和72 h終止培養(yǎng)，同時設(shè)置不加菌液的平行對照組。

1.7蘇木精-伊紅（HE）染色 組織工程皮膚用4%甲醛固定后，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、切片和染色，光鏡下觀察。

1.8過碘酸雪夫（PAS）染色 按照試劑盒步驟進(jìn)行，切片按常規(guī)脫蠟水洗，1%～2%淀粉酶消化25 min后，充分洗滌，0.5%～1%過碘酸水溶液氧化5 min；水洗后Schiff氏試劑染15 min；充分洗滌后明礬蘇木精染核，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。

2　結(jié)果

2.1HE染色觀察構(gòu)建的含色素的組織工程皮膚形態(tài) 牛膠原和成纖維細(xì)胞形成的組織工程真皮質(zhì)地均勻，可見散在呈梭形的成纖維細(xì)胞分布于膠原纖維束之間；角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞在組織工程真皮表面氣液界面培養(yǎng)10天后，可見表皮層次均勻、結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞分化達(dá)8～10層，見圖1。

2.2糠秕馬拉色菌感染的組織工程皮膚后HE染色結(jié)果 糠秕馬拉色菌作用于組織工程皮膚12 h、24 h、48 h和72 h，隨著感染時間延長，組織工程皮膚結(jié)構(gòu)未見明顯變化，表皮形態(tài)與空白對照組一致，表皮均未見明顯破壞，在48 h和72 h時，表皮上表面可見大量馬拉色菌繁殖（圖2）。

2.3糠秕馬拉色菌感染的組織工程皮膚后PAS染色結(jié)果 糠秕馬拉色菌作用12 h后，表皮層上方可見少許芽生孢子，偶見個別芽生孢子黏附于表皮的上表面（圖3a箭頭所示）；感染24 h后，芽生孢子數(shù)量增加，常見群集芽生孢子黏附聚集于表皮層表面，但孢子并未侵入表皮層內(nèi)（圖3b）；感染48 h后，芽生孢子由粘附轉(zhuǎn)為侵入表皮層上部（圖3c）；感染72 h后，芽生孢子仍主要分布于表皮層淺層，侵入深度較前有所加大（圖3d）。

圖1　角質(zhì)形成細(xì)胞（a）和黑素細(xì)胞（b）在膠原和成纖維細(xì)胞形成的組織工程真皮表面培養(yǎng)10天后（HE，×200）

圖2　糠秕馬拉色菌感染組織工程皮膚12 h（a），24 h（b），48 h（c）和72 h（d）后（HE，×100）

圖3　糠秕馬拉色菌感染組織工程皮膚12 h（a），24 h（b），48 h（c）和72 h（d）后，PAS染色后油鏡下觀察結(jié)果（×1000）

3　討論

本研究在前期構(gòu)建的含色素的人源性組織工程皮膚的基礎(chǔ)上，利用馬拉色菌相關(guān)疾病中較常見的糠秕馬拉色菌對其進(jìn)行感染，初步建立糠秕馬拉色菌感染的組織工程模型。結(jié)果顯示，隨著糠秕馬拉色菌感染時間的延長，組織工程皮膚的基本結(jié)構(gòu)不被該菌體破壞，芽生孢子密度隨著時間延長而增加，對于組織工程皮膚的侵襲僅限于表皮淺層。

馬拉色菌作為最常見的皮膚真菌感染菌之一，關(guān)于馬拉色菌致病機制的體外研究方面，有研究將馬拉色菌在體外含油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分析其分泌各種生物活性產(chǎn)物在其致病過程中可能發(fā)揮的作用，由于體外培養(yǎng)與該菌體在人體皮膚表面作用時的環(huán)境相差較大，馬拉色菌分泌物的類型和模式會有較大差異，因此需要更理想的體外模型證實其各種分泌產(chǎn)物的作用。

早在上個世紀(jì)末Bhattacharyya等10首次利用I型鼠尾膠原復(fù)合成纖維細(xì)胞構(gòu)建組織工程真皮，在其上培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建出組織工程皮膚，利用糠秕馬拉色菌感染該模型后，進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)糠秕馬拉色菌僅侵襲表皮上部，對皮膚組織的破壞極小。Holland等11在組織工程皮膚構(gòu)建的基礎(chǔ)上，利用低濃度表皮葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌、馬拉色菌等常駐菌群感染該模型建立體外微生態(tài)模型，檢測隨感染時間延長各種病原體數(shù)量平穩(wěn)上升，模型最長可維持120 h。

基于以上出發(fā)點，為了在體外建立更接近于馬拉色菌感染的實際環(huán)境，本研究在含色素的組織工程皮膚構(gòu)建的基礎(chǔ)上建立了糠秕馬拉色菌感染模型，在感染的不同時間段進(jìn)行切片觀察，結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時間的不斷延長，HE染色中，組織工程皮膚結(jié)構(gòu)始終保持完整，未見破壞。PAS染色顯示，隨著感染時間的延長，糠秕馬拉色菌芽生孢子由最初低密度黏附于表皮上方逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榍秩氡砥ど喜??？凤躐R拉色菌對組織工程皮膚的感染模式顯示其對組織工程皮膚的破壞力極低，侵入范圍僅限于表皮淺層。這一特征符合馬拉色菌作為角層真菌，只侵犯角質(zhì)層而不侵犯基底層、真皮及真皮深層的特點。與國外的類似研究有著相似的結(jié)果，與國外的研究相比，本研究所建立的模型中包含有黑素細(xì)胞，對馬拉色菌相關(guān)的色素性疾病的研究更有優(yōu)勢，同時表皮的主要成分是由角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞，在對抗外源性微生物過程中，可能存在細(xì)胞間的交互對話及協(xié)同作用，因此，含色素的組織工程皮膚馬拉色菌感染模型在其致病機制的研究中更有優(yōu)勢。

1 Pedrosa AF，Lisboa C，Rodrigues AG.Malassezia infections：A medical conundrum.J Am Acad Dermatol，2014，71（1）：170-176.

2 Gaitanis G，Velegraki A，Mayser P，et al.Skin diseases associated with Malassezia yeasts：facts and controversies.Clin Dermatol，2013，31（4）：455-463.

3曹玉萍，周武慶，馬鵬程，等.組織工程表皮與單核白血病細(xì)胞共培養(yǎng)的致敏性檢測模型.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（20）：3641-3644.

4曹玉萍，周武慶，馬鵬程，等.用HaCaT細(xì)胞和正常人黑素細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚.毒理學(xué)雜志，2009，23（5）：341-344.

5 Saadatzadeh MR，Ashbee HR，Cunliffe WJ，et al.Cell-mediated immunity to themycelial phase of Malassezia spp.in patients with pityriasis versicolor and controls.Br JDermatol，2001，144（1）：77-84.

6 Kesavan S，Holland KT，Ingham E.The effects of lipid extraction on the immunomodulatory activity of Malassezia species in vitro.Med Mycol，2000，38（3）：239-247.

7羅東輝，王俠生.糠秕孢子菌誘導(dǎo)培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的研究.臨床皮膚科雜志，2000，29（6）：336-338.

8陳菊萍，冉玉平，魏大鵬，等.馬拉色菌與人角質(zhì)形成細(xì)胞株共同培養(yǎng)液對培養(yǎng)人黑素細(xì)胞生長及酪氨酸酶mRNA表達(dá)的影響.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2006，22（2）：122-124.

9冉玉平，周光平，坪井良治，等.糠秕孢子菌與培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞的相互作用.中華皮膚科雜志，1997，30（5）：294-298.

10Bhattacharyya T，Edward M，Cordery C，et al.Colonization of living skin equivalents by Malassezia furfur.Med Mycol，1998，36（1）：15-19.

11 Holland DB，Bojar RA，Jeremy AH，et al.Microbial colonization of an in vitromodel of a tissue engineered human skin equivalent-a novel approach.FEMS Microbiol Lett，2008，279（1）：110-115.

（收稿：2015-05-17 修回：2015-07-16）

·病例報告·

Construction of tissue-engineered skin for themodel of Malassezia furfur infection

CAO Yu-ping，SHEN Yong-nian，LVGui-xia，etal.Institute ofDermatology，Chinese Academy ofMedical Sciences&Peking Union Medical College，Nanjing，210042

Objective：To constructan in vitromodel of tissue-engineered skin for Malassezia furfur infection.M ethods：The tissue engineered dermis was used to constructwith primary cultured fibroblasts and bovine collagenm ixed solution.And then，keratinocytes and melanocyteswere seeded on the surface of the engineered dermiswith themethod ofair-liquid interface culture.The suspension of Malassezia furfur was inoculated with the pigmented tissue-engineered skin.At different time points，HE staining and PAS staining were performed.Resu lts：The structure of the tissue engineered skin was intactand compact，with 8-10 cell layers. Blastospores of Malassezia furfur were only seen in the upper of epiderm is over time through the hematoxylineosin staining and periodic acid-schiff staining.Conclusion：Malassezia furfur infected tissue-engineered skin was successfully established，which can be used for a studymodels of Malassezia furfur infection in vitro.

Malassezia furfur；tissue engineering

江蘇省自然科學(xué)基金項目（編號：BK2008092）

江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專項（編號：BL2012003）

2014年度北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院協(xié)和青年基金（編號：33320140051）

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，江蘇南京，210042