張　華，南文龍，鞏明霞，張悅勇，3，彭大新，陳義平

（1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島　266032；

2. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州　225009；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島　266109）

雞傳染性法氏囊病血清抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立

張華1，2，南文龍1，鞏明霞1，張悅勇1，3，彭大新2，陳義平1

（1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032；

2. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109）

為建立可檢測(cè)雞傳染性法氏囊病血清抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，本研究經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增IBDV VP2（1nt-708nt）基因片段，并應(yīng)用pET28a載體進(jìn)行原核表達(dá)，親和層析純化重組蛋白作為包被抗原，建立檢測(cè)IBDV血清抗體的間接ELISA方法。應(yīng)用所建方法和IDEXX試劑盒，對(duì)采自不同地區(qū)的156份雞血清樣品進(jìn)行平行檢測(cè)和比較。結(jié)果表明，RT-PCR擴(kuò)增獲得708bp的VP2基因片段；含重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-VP2的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)了約27kDa的VP2重組蛋白，表達(dá)量約占菌體蛋白的30.1%；建立的間接ELISA檢測(cè)方法與IDEXX試劑盒比較，其特異性、敏感性和符合率分別達(dá)到90.24%、95.65%和94.23%。由此可見(jiàn)，本研究所建立的間接ELISA方法敏感、特異，適用于IBDV血清抗體的檢測(cè)。

傳染性法氏囊病；VP2；原核表達(dá)；間接ELISA

傳染性法氏囊病（infectious bursal disease，IBD）是由傳染性法氏囊病毒（IBDV）引起的雞的一種急性高度接觸性傳染病［1］。IBDV主要侵害法氏囊B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致免疫損傷，并誘發(fā)多種疫病以及疫苗免疫失?。?］。準(zhǔn)確診斷和監(jiān)測(cè)是防控該病的關(guān)鍵，IBDV血清抗體檢測(cè)方法主要有瓊脂擴(kuò)散和ELISA方法。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)存在靈敏度較低、耗時(shí)長(zhǎng)并且無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)等缺陷。ELISA方法特異、敏感，并可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，是IBDV血清抗體理想的檢測(cè)方法［3］。

VP2是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是構(gòu)成病毒衣殼的主要成分，也是主要的宿主保護(hù)性抗原［4］。VP2基因全長(zhǎng)約為1.4kb，有關(guān)研究顯示VP2蛋白的212～214和248～252 位氨基酸的兩個(gè)親水區(qū)分別與IBDV抗原結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和毒力大小有關(guān)［5］。本研究擬對(duì)VP2基因上半段進(jìn)行原核表達(dá)，并以純化的重組蛋白作為檢測(cè)用抗原，建立檢測(cè)IBDV血清抗體的間接ELISA方法。

1　材料

1.1毒株及血清樣品

IBDV B87株及其陽(yáng)性血清由青島易邦生物工程有限公司提供；H5、H7、H9亞型禽流感病毒陽(yáng)性血清、新城疫病毒陽(yáng)性血清均由本室免疫SPF雞制備；SPF雞血清為本室采集保存；156份臨床雞血清樣品采自山東和江蘇的部分雞場(chǎng)（其中121份經(jīng)IBDV疫苗免疫，35份未免IBDV疫苗 ）。

1.2主要試劑

Taq DNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、內(nèi)切酶、病毒RNA提取試劑盒、pMD18-T克隆載體購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa）公司；pET-28a表達(dá)載體購(gòu)自L(fǎng)ife公司；Ni SepharoseTM 6 Fast Flow購(gòu)自GE Healthcare公司；山羊抗雞IgG-HRP購(gòu)自美國(guó)BETHYL公司；酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)康寧公司。

2　方法

2.1IBDV VP2基因擴(kuò)增

按試劑盒說(shuō)明方法，提取IBDV B87株基因組RNA，Oligo（dt）常規(guī)方法逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板。根據(jù)GeneBenk發(fā)表的IBDV VP2全基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，P1：5'-TCGAATTCATGACAAACCTGCAAGATC-3'；P2：5'-GCTCTCGAGGGCATCGATATTAGCTG-3'，其中引物P1和P2的5'端分別引入EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增VP2基因1nt～708nt位置基因片段。引物由大連寶生物公司合成。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性40s，57℃退火40s，72℃延伸75s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，PCR 產(chǎn)物送寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。

2.2重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

回收VP2目的基因，連接pMD18-T載體，構(gòu)建陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pMD18-T-VP2。EcoR I、Xho I雙酶切pMD18-T-VP2和pET-28a載體，連接VP2基因與pET-28a載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-VP2［6］。

2.3重組蛋白的表達(dá)及純化

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-VP2轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，以終濃度為1mg/mL的IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)5h，12%SDS-PAGE凝膠電泳分析表達(dá)產(chǎn)物。常規(guī)方法回收包涵體蛋白，并經(jīng)鎳柱親和層析法純化，Qubit 2.0儀器測(cè)定重組蛋白濃度，Westernblot分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性。

2.4間接ELISA方法的建立及條件優(yōu)化

以純化的VP2重組蛋白作為包被抗原，用0.05 M pH 9.6的碳酸鹽包被緩沖液進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)舛确秶?000ng/mL～250ng/mL），每孔加入100μL，4℃包被過(guò)夜。同時(shí)，將SPF雞陰性血清和IBDV陽(yáng)性血清分別進(jìn)行50倍、100倍、200倍和400倍稀釋?zhuān)蚩闺uIgG-HRP酶標(biāo)二抗按1∶5000稀釋?zhuān)M(jìn)行方陣測(cè)定，確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。然后再對(duì)各反應(yīng)時(shí)間以及酶標(biāo)二抗工作濃度等條件逐一優(yōu)化。

2.5交叉反應(yīng)的檢測(cè)

用建立好的間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)H5、H7、H9亞型禽流感病毒陽(yáng)性血清以及新城疫病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，觀(guān)察是否發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.6血清樣品檢測(cè)

用建立的間接ELISA方法檢測(cè)156份雞血清樣品，并用美國(guó)IDEXX公司的IBDV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒平行檢測(cè)，比較分析檢測(cè)結(jié)果。

3　結(jié)果與分析

3.1IBDV VP2基因的擴(kuò)增結(jié)果

IBDV VP2基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1，擴(kuò)增獲得708bp的VP2基因片段。

3.2重組克隆和表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定

將構(gòu)建的重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-VP2和表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-VP2經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切，鑒定結(jié)果分別如圖2和圖3，兩者經(jīng)酶切均出現(xiàn)VP2目的基因條帶和載體條帶，大小同預(yù)期一致。

3.3IBDV VP2蛋白的表達(dá)以及抗原性分析

圖1　IBDV VP2基因RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖2　克隆載體pMD18-T-VP2雙酶切鑒定結(jié)果

圖3　表達(dá)載體pET-28a -VP2雙酶切鑒定結(jié)果

用BandScan軟件對(duì)SDS-PAGE結(jié)果（圖4）進(jìn)行分析，結(jié)果表明在約27kDa處出現(xiàn)VP2重組蛋白表達(dá)，表達(dá)量約占大腸桿菌的30.1%。經(jīng)Qubit 2.0測(cè)定，純化后的VP2重組蛋白濃度為2.5mg/mL。Western-blot結(jié)果（圖5）顯示，VP2重組蛋白能與IBDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表達(dá)的VP2 蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。

圖4　重組蛋白的SDS-PAGE 分析結(jié)果

圖5　重組蛋白Western-blot鑒定結(jié)果

3.4檢測(cè)IBDV血清抗體間接ELISA方法的建立方陣試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6，當(dāng)抗原工作濃度為250ng/ mL和血清50倍稀釋時(shí)，P/N值雖然較大，但由于此時(shí)抗原濃度較小，所有樣品OD值總體偏低，會(huì)影響本方法的靈敏度。當(dāng)抗原工作濃度為1000ng/ mL和血清100倍稀釋時(shí)，P/N值較為理想，易于分辨陰、陽(yáng)性結(jié)果，選擇作為抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。

圖6　方陣試驗(yàn)結(jié)果

進(jìn)一步對(duì)反應(yīng)時(shí)間及酶標(biāo)二抗工作濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定的ELISA反應(yīng)程序：將純化的VP2 重組蛋白用用0.05mol/L pH 9.6的碳酸鹽包被緩沖液稀釋至1000ng/mL，100 μL/孔包被酶標(biāo)板，4℃包被過(guò)夜；PBST洗滌3 次，然后每孔加300μL 2% BSA封閉液，37℃封閉2h；PBST洗滌3次，分別加入100倍稀釋的待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照血清（2 個(gè)）和陰性對(duì)照血清（2個(gè)），每孔100μL，37℃孵育30min；PBST洗滌3 次，再每孔加入100μL 2500 倍稀釋的山羊抗雞IgGHRP，37℃孵育30 min；PBST洗滌3次，每孔加入100μL新配置的TMB顯色液，37℃顯色10 min；最后，每孔加入50μL 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。測(cè)定OD450值。分別計(jì)算出陽(yáng)性對(duì)照平均值ODP和陰性對(duì)照平均值ODN，待檢血清樣品OD450＞0.6×ODP+0.4×ODN判定為陽(yáng)性；待檢樣品OD450 ≤0.6×ODP+0.4×ODN判定為陰性。

3.5交叉反應(yīng)的檢測(cè)

交叉反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果顯示，H5亞型禽流感病毒陽(yáng)性血清、H7亞型禽流感病毒陽(yáng)性血清、H9亞型禽流感病毒和新城疫病毒陽(yáng)性血清經(jīng)檢測(cè)均為陰性，表明所建立的間接ELISA方法與禽流感、新城疫等常見(jiàn)病毒病陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。

3.6156份雞血清樣品檢測(cè)結(jié)果

利用所建立的間接ELISA方法（VP2-ELISA）與IDEXX ELISA檢測(cè)試劑盒平行檢測(cè)156份臨床血清樣品（表1）。VP2-ELISA檢測(cè)出114份陽(yáng)性和42份陰性；IDEXX ELISA試劑盒檢測(cè)出115份陽(yáng)性和41份陰性。但是，在IDEXX ELISA試劑盒檢測(cè)為陰性的41份樣品中，有4份樣品VP2-ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性；在IDEXX ELISA試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性的115份樣品中，有5份樣品VP2-ELISA檢測(cè)為陰性。與IDEXX ELISA試劑盒相比， VP2-ELISA方法的特異性、敏感性和符合率分別為90.24%（37/41）、95.65%（110/115）和 94.23%（147/156）。

4　討論

Marquardt［6］于1980年首次將ELISA檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用到IBD的診斷中，并成功地從臨床雞血清樣品中檢測(cè)出IBDV特異性抗體。2010年，Niraj［7］等將大腸桿菌中表達(dá)的IBDV VP3蛋白和酵母菌中表達(dá)的VP2蛋白以及疫苗株全病毒抗原進(jìn)行包板，分別建立了檢測(cè)IBD血清抗體的間接ELISA方法：VP3-ELISA 、VP2-ELISA和W-ELISA，比較發(fā)現(xiàn)VP3-ELISA和VP2-ELISA檢測(cè)結(jié)果相似，而W-ELISA的特異性和敏感性相對(duì)較差。其中，VP2-ELISA與病毒中和試驗(yàn)相比，其符合率、特異性和敏感性達(dá)到95%、95.9%和96.1%，效果與IDEXX ELISA試劑盒相當(dāng)。國(guó)內(nèi)也有相關(guān)的研究報(bào)道，馬秀麗等［8］建立了全病毒作為檢測(cè)抗原建立了間接ELISA方法，與進(jìn)口試劑盒相比，符合率達(dá)到86.7%；宋軍等［9］也報(bào)道了VP2間接ELISA方法，并證明該方法具有良好的特異性。為了提高表達(dá)量及獲得理想的檢測(cè)效果，研究過(guò)程中我們?cè)侄伪磉_(dá)了VP2基因，包括上半段（1nt-708nt）、下半段（652nt-1353nt）和全長(zhǎng)（1nt-1353nt）。結(jié)果顯示，VP2上半段基因基因表達(dá)效果較好。而且，我們還將VP2上半段基因、下半段基因以及全基因重組蛋白均作為檢測(cè)抗原，包被酶標(biāo)板，比較了三者ELISA方法的檢測(cè)效果。結(jié)果表明，應(yīng)用VP2上半段基因建立的ELISA方法，檢測(cè)時(shí)陰性樣品背景值較低，陽(yáng)性樣品OD值較高，P/N值大，更易于陰、陽(yáng)性結(jié)果的分辨。因此，本研究最終選擇以VP2上半段基因重組蛋白作為檢測(cè)抗原，優(yōu)化建立了檢測(cè)IBDV血清抗體的間接ELISA方法。與IDEXX ELISA試劑盒相比，本方法符合率94.23%、特異性90.24%、敏感性95.65%，檢測(cè)效果較為理想，可用于臨床IBDV血清抗體的檢測(cè)。

表1 VP2-ELISA和INDEXX ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較

［1］ Hair-Bejo M，Ng M K，Ng H.Y. Day Old Vaccination Against Infectious Bursal Disease in Broiler Chickens［J］. International Journal of Poultry Science，2004，3（2）：124-128.

［2］ Martínez-Torrecuadrada J L，Lázaro B，Rodriguez J F，et al. VPX and VP3 Infectious Bursal Disease Virus Proteins Potential of Baculovirus-Expressed Antigenic Properties and Diagnostic［J］. Clinical and Vaccine Immunology，2000，7（4）：645- 651.

［3］ 陳義平，鄧珣，彭長(zhǎng)凌，等.PRRSV血清抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立［J］.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27（4）：1-4.

［4］ Zanetti F A，Del Médico Zajac M P，Taboga O A，et al. Evaluation of modifi ed vaccinia virus Ankara expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus as an immunogen in chickens［J］. Journal of Veterinary Science，2012， 13（2）：199-201.

［5］ Bayliss C D，Spies U，Shaw K，et a1. A comparison of segment A of four infectious bursal disease virus strains and identification of a variable region in VP2 ［J］. Journal of General Virology，1990，71（6）：1303-1312.

［6］ 周潔，陳義平，楚電峰，等.豬細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2主要抗原表位區(qū)基因的克隆及原核表達(dá)［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009，26（2）：42-44.

［7］ Singh N K，Dey S，Madhan Mohan C， et al. Evaluation of four enzyme linked immunosorbent assays for the detection of antibodies to infectious bursal disease in chickens［J］. Journal of Virological Methods，2010，65（2）：277-282.

［8］ 馬秀麗，崔言順，張秀美，等.雞傳染性法氏囊病間接ELISA診斷試劑盒的研制及初步應(yīng)用［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，23（5）：424-426.

［9］ 宋軍，黃成斌，單雪芹，等.傳染性法氏囊病毒VP2蛋白的表達(dá)及間接ELlSA抗體檢測(cè)方法的建立［J］. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，38（4）：633-636.

（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Development of an Indirect ELISA for the Detection of Antibodies against Infectious Bursal Disease Virus in Chickens

Zhang Hua1，2，Nan Wenlong1，Gong Mingxia1，Zhang Yueyong1，3，Peng Daxin2，Chen Yiping1
（1.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Key Laboratory of Animal Infectious Diseases， Ministry of Agriculture，College of Veterinary Medicine，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009；3. Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shangdong 266109）

In order to develop an indirect ELISA for the detection of antibodies against IBDV， VP2 gene（1nt～708nt）was amplifi ed by RT-PCR and expressed using the pET-28a vector in Escherichia coli BL21. The recombinant protein was purifi ed through Ni-chelating affi nity chromatography and based on it，an indirect ELISA was developed. To verify the performance of this assay， 156 clinical serum samples were detected by the assay and IDEXX ELISA kit in parallel. The results showed that VP2 gene was successfully amplifi ed by RT-PCR and expressed in E.coli BL21 with IPTG induction. Compared to IDEXX ELISA kit， the specifi city，sensitivity，and coincidence rate of the developed indirect ELISA were 90.24%，95.65% and 94.23% respectively.The results demonstrated the assay was sensitive and specifi c，and could be used to detect antibodies against IBDV in chicken sera.

IBDV；VP2；prokaryotic expression；indirect ELISA

S852.65+7

A

1005-944X（2015）09-0072-05

陳義平