趙永剛，鄒艷麗，張永強(qiáng)，吳曉東，王清華，王志亮

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島　266032）

蘇丹型埃博拉病毒焦磷酸測(cè)序方法的建立

趙永剛，鄒艷麗，張永強(qiáng)，吳曉東，王清華，王志亮

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032）

［目的］ 本研究旨在通過(guò)對(duì)埃博拉病毒進(jìn)行序列信息分析的基礎(chǔ)上，利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)蘇丹型埃博拉病毒進(jìn)行快速檢測(cè)和鑒定。［方法］ 通過(guò)序列信息比對(duì)，設(shè)計(jì)蘇丹型埃博拉病毒基因保守區(qū)段的擴(kuò)增引物及測(cè)序引物。通過(guò)人工方法合成一段基因序列，PCR擴(kuò)增目的基因片段，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄制備cRNA，RT-PCR擴(kuò)增目的基因片段，采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)針對(duì)目的基因進(jìn)行保守核苷酸區(qū)段的測(cè)序分析。［結(jié)果］ 通過(guò)序列信息比對(duì)尋找到蘇丹型埃博拉病毒基因型的核苷酸保守區(qū)段，經(jīng)焦磷酸測(cè)序后能進(jìn)一步確證毒株的序列信息為蘇丹型埃博拉病毒。經(jīng)過(guò)與華大基因公司進(jìn)行Sanger法測(cè)序比較，結(jié)果完全一致。［結(jié)論］ 基于序列分析的焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以作為進(jìn)一步確證方法使用。

蘇丹型埃博拉病毒；序列比對(duì)；焦磷酸測(cè)序

近幾年，外來(lái)動(dòng)物疫病傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)不斷上升，隨著小反芻獸疫等外來(lái)動(dòng)物疫病的發(fā)生，非洲豬瘟、尼帕、埃博拉等外來(lái)動(dòng)物疫病步步緊逼我國(guó)。至今未查明其自然宿主動(dòng)物通過(guò)與病人接觸或者通過(guò)院內(nèi)感染傳播的埃博拉出血熱于1976年首次出現(xiàn)［1］，很快以其高度傳染性的暴發(fā)流行和高度致死性引起研究者極大關(guān)注，并引發(fā)了對(duì)埃博拉病毒及埃博拉出血熱的一系列研究。

埃博拉出血熱（Ebola hemorrhagic fever， EBHF）是由埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV ）引起的人類和靈長(zhǎng)類嚴(yán)重出血熱疾?。?～6］，因EBOV首次是1976年在扎伊爾北部的埃博拉河流附近一個(gè)名叫楊博科的小村莊發(fā)現(xiàn)，故命名為埃博拉病毒和埃博拉出血熱。

EBOV 屬絲狀病毒科（Filoviridae），與馬爾堡病毒（Marberg virus） 共同構(gòu)成絲狀病毒屬（Filovirus）。根據(jù)發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)的不同 EBOV 可分為五個(gè)亞型，即埃博拉病毒-扎伊爾型（EBOV-Z）、埃博拉病毒-蘇丹型（EBOV-S）、埃博拉病毒-萊斯頓型（EBOV-R）、埃博拉病毒-科特迪瓦型（EBOV-C）［7］和埃博拉病毒-本迪布焦型（EBOV-B）［8］。不同亞型的毒力各不相同，其對(duì)人類毒力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篍BOV-Z＞EB0V-S＞EBOV-B＞EBOVC＞EBOV-R［8-9］。其中扎伊爾型、蘇丹型、本迪布焦型、科特迪瓦型對(duì)人類有致病性，萊斯頓型僅在非人靈長(zhǎng)類中引發(fā)疾病和死亡，人類也可能感染這種病毒從而成為無(wú)癥狀的病毒攜帶者［10-11］。世界衛(wèi)生組織已將EBOV列為對(duì)人類危害最嚴(yán)重的病毒之一，即第4級(jí)病毒。試驗(yàn)操作要求必須在P4級(jí)高度安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行［12］。2009年菲律賓發(fā)生豬感染萊斯頓型病毒并傳染給人的疫情［13］，目前，我國(guó)尚沒(méi)有埃博拉病毒感染或輸入的報(bào)道，因此需要高度重視，并做好檢測(cè)和防控的技術(shù)儲(chǔ)備。

埃博拉病毒可以人-人傳播，對(duì)人類危害極大，易被恐怖分子用作生物戰(zhàn)劑。《國(guó)際禁止生物武器公約》已將 EBOV 列為潛在的致死性生物試劑，應(yīng)引起高度重視。深入研究埃博拉病毒的致病機(jī)制及建立埃博拉病毒檢測(cè)方法，對(duì)預(yù)防和控制埃博拉出血熱具有非常重要的意義。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)（Pyrosequencing）是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種能夠進(jìn)行定量序列測(cè)定的新技術(shù)，具有高通量、快速、敏感等特點(diǎn)。目前該技術(shù)在物種鑒定、病毒快速鑒定和分型、微生物的檢測(cè)等方面已有廣泛的應(yīng)用［14］。本研究根據(jù)埃博拉病毒基因序列的保守性，建立了埃博拉的PCR-焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法。

1　材料

1.1材料

蘇丹型埃博拉病毒L基因保守區(qū)段由大連寶生物工程有限公司合成，由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心保存。

1.2主要試劑和儀器

Transcriptor One-Step RT-PCR Kit，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司；IDEXX BVDV Ag Serum Plus病原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司；Pyro Gold SQA Reagents 1×96 Pyromark ID購(gòu)自Biotage AB公司；PyroMark Q96 MD儀器購(gòu)自QIAGEN。

2　方法

2.1引物設(shè)計(jì)

選取GenBank中EBOV的毒株及其登錄號(hào)Reston Ebola virus（AF522874.1）、Sudan Ebola virus EBOV-S-2004（EU338380.1）、Zaire Ebola virus strain Zaire 1995（AY354458）等100多條核苷酸序列，經(jīng)Megalign比對(duì)，選出L基因高度保守且特異核苷酸區(qū)域，運(yùn)用PSQ Assay Design軟件進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物和一條測(cè)序引物（表1，2），其中通用引物的下游引物在5端采用生物素標(biāo)記。引物均由大連寶生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 擴(kuò)增引物及序列

表2 測(cè)序引物及序列

2.2陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

以合成的L基因?yàn)槟０澹煤蠺7啟動(dòng)子的擴(kuò)增引物EBOV3/EBOV2（Biotin）擴(kuò)增EBOV-S L基因保守區(qū)。反應(yīng)體系為：模板1μL，PCR Mix 25μL，上下游引物各2μL，最后添加滅菌dd H2O至50μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 5min；94℃變性 30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為274bp。PCR結(jié)束后 ，進(jìn)行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用膠回收試劑盒切膠回收目的條帶，并克隆到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ecoli JM109感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，PCR鑒定獲得含目的基因片段的重組質(zhì)粒，純化后并測(cè)序。-20℃保存?zhèn)溆?。

2.3體外轉(zhuǎn)錄

2.3.1體外轉(zhuǎn)錄模板的制備

以構(gòu)建的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒為模板，T7啟動(dòng)子的擴(kuò)增引物EBOV3， EBOV2為引物擴(kuò)增的目的片段即為體外轉(zhuǎn)錄的模板。反應(yīng)液用Fermentas公司的普通PCR試劑盒。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃30s，56℃ 30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像觀察結(jié)果。切下陽(yáng)性條帶，用膠回收試劑盒回收目的片段，用核酸濃度測(cè)定儀定量。

2.3.2體外轉(zhuǎn)錄

用購(gòu)自Fermentas生物試劑公司TranscriptAid T7 High Yield Transcription kit進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.4RT-PCR擴(kuò)增

將以上體外轉(zhuǎn)錄模板稀釋100倍，進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增：體外轉(zhuǎn)錄稀釋的模板1μL，RT-PCR Mix 25μL，EBOV2 2μL，EBOV3 2μL，ddH2O 20μL，總體系50μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃30min；95℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，57℃退火45s，72℃延伸45s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。結(jié)果用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，RTPCR產(chǎn)物膠回收后進(jìn)行濃度測(cè)定。

2.5焦磷酸單鏈模板制備

根據(jù)Gene Company Limited公司的焦磷酸測(cè)序反應(yīng)操作說(shuō)明制備測(cè)序單鏈模板。將45μL RTPCR單鏈模板分別加入到PSQ 96板的孔中，并加入測(cè)序引物，在85℃的烘箱中放置2min，取出冷卻后就可進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

2.6焦磷酸測(cè)序反應(yīng)

將放有樣品的PSQ96孔板80℃孵育2 min，冷卻至室溫后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)。將酶混合物、底物混合物和四類核苷酸（A、T、C和G）分別加入試劑艙固定位置。設(shè)定程序，將試劑艙和PSQ96孔板放入PSQ TM 96 MD System儀器中中進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。根據(jù)PSQTM 96MA System儀器的軟件說(shuō)明在試劑艙中分別加入的底物APS、dNTP和 酶混合物（DNA聚合酶、熒光素酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶）；然后將試劑艙和PSQ 96板放入，進(jìn)行焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing）反應(yīng)。

2.7敏感性試驗(yàn)

以體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用優(yōu)化好的RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并進(jìn)行濃度測(cè)定。將RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍稀釋后，進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，確定試驗(yàn)的敏感性。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

將擴(kuò)增的RT-PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行3次焦磷酸測(cè)序，比較每次測(cè)得的序列結(jié)果，確定試驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

3　結(jié)果

3.1PCR擴(kuò)增結(jié)果 利用設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增埃博拉病毒的特異基因片段，擴(kuò)增出長(zhǎng)度為274bp的目的片段（圖1）。

圖1　蘇丹型埃博拉病毒L基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.2RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

按RT-PCR程序擴(kuò)增埃博拉病毒核酸基因材料，所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物能擴(kuò)增出與設(shè)計(jì)相符的試驗(yàn)結(jié)果（294 bp）。將反應(yīng)體系增加到100 μL 以獲得足夠量的目的片斷。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用DNA純化回收試劑盒純化，并送華大基因公司進(jìn)行Sanger法測(cè)序。電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2　蘇丹型埃博拉病毒L基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.3焦磷酸測(cè)序反應(yīng)

焦磷酸測(cè)序結(jié)果按照10（TGAC）堿基順序加入程序進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，可很好測(cè)得蘇丹型埃博拉病毒L基因的目的片段序列，經(jīng)NCBI的在線BLAST分析確證為蘇丹型埃博拉L基因片段，測(cè)序結(jié)果完全正確。后經(jīng)在線BIAST分析發(fā)現(xiàn)TGGCAATCAGTTGGACACAl8個(gè)堿基的一段序列即可達(dá)到對(duì)埃博拉病毒的鑒定目的（圖3）。

圖 3 蘇丹型埃博拉病毒L基因焦磷酸測(cè)序圖譜結(jié)果

3.4敏感性鑒定結(jié)果

將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板的RT-PCR產(chǎn)物稀釋8個(gè)梯度，即2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍稀釋，稀釋后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。結(jié)果證實(shí)本方法的敏感性為102.8EID50，仍然能夠成功測(cè)出靶序列（圖略）。

3.5重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)每個(gè)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行3次重復(fù)性檢測(cè)，檢測(cè)的結(jié)果均一致，證明該方法有很好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

4　討論

埃博拉病毒有著感染性極強(qiáng)，致死率極高的特點(diǎn)，致死率可達(dá)50%～90%［15］。對(duì)人類健康危害很大。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織已將埃博拉病毒列為對(duì)人類危害最嚴(yán)重的病毒之一。尤其當(dāng)今社會(huì)恐怖活動(dòng)日益增多，不排除用EBOV制作生化武器的可能。因此我們應(yīng)該高度重視EBOV，著手于早期防控工作［16］。

目前針對(duì)類似埃博拉出血熱這樣的突發(fā)性烈性傳染性疾病，我們應(yīng)及早確定病毒傳染源，將有利于做出早期診斷，隔離傳染源，切斷傳播途徑，阻止疫情進(jìn)一步迅速擴(kuò)大。輔助流行病學(xué)調(diào)查的實(shí)驗(yàn)診斷手段將提供更可靠的研究典范。本次研究就是生物信息學(xué)分析結(jié)合應(yīng)用先進(jìn)實(shí)驗(yàn)手段的一個(gè)例子，它的應(yīng)用價(jià)值在于PSQ 技術(shù)是一種比較新穎的技術(shù)，（1）它可以專門對(duì)預(yù)測(cè)的突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，避免了全基因測(cè)序；（2）本研究以生物信息學(xué)研究為基礎(chǔ)，結(jié)合PSQ 技術(shù)，建立了通過(guò)核酸多態(tài)性特征確定萊斯頓型埃博拉病毒株的快速鑒定方法，對(duì)于突發(fā)埃博拉事件是很好的快速應(yīng)急鑒定方法；（3）通過(guò)本研究證實(shí)上海獸醫(yī)研究所送檢樣品為埃博拉陰性，對(duì)于流行病學(xué)調(diào)查提供了有力證據(jù)。其它流行性疾病也可以用類似方法追查其傳染源，控制疾病傳播，對(duì)于流行性疾病的控制有很大幫助。

本實(shí)驗(yàn)所建立的PCR-焦磷酸測(cè)序檢測(cè)EBOV-S的方法體現(xiàn)了該方法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性 好、自動(dòng)化程度高、低成本、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可一次性檢測(cè)96份樣品，有望成為一種快速檢測(cè)病原的技術(shù)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在測(cè)序反應(yīng)中，將測(cè)序引物濃度從0.3M調(diào)至0.6M時(shí)，能得到峰值更高的圖形與結(jié)果。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)（pyrosequencing）是近年發(fā)展起來(lái)的一種能夠通過(guò)對(duì)基因序列測(cè)序?qū)崿F(xiàn)檢測(cè)和確診的新型檢測(cè)技術(shù)，具有高通量、快速、敏感等特點(diǎn)［17］，其基本原理是設(shè)計(jì)帶有生物素標(biāo)記的擴(kuò)增引物，通過(guò)PCR反應(yīng)生成含有生物素標(biāo)記的目的基因片段，然后制備測(cè)序單鏈模板。將待測(cè)單鏈模板與測(cè)序引物雜交結(jié)合，放入PSQTM 96MD System中進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。與普通RT-PCR和real time RT-PCR等檢測(cè)技術(shù)相比，本技術(shù)無(wú)需將PCR產(chǎn)物電泳及無(wú)需送交公司測(cè)序以便確診，從而大大減少了病原確診時(shí)間。焦磷酸測(cè)序操作簡(jiǎn)單方便，可程序化，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程和規(guī)范，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性［18］。蘇丹型埃博拉病毒焦磷酸測(cè)序方法的建立為今后動(dòng)物疫病檢測(cè)技術(shù)的研究提供了新的思路。

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（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Establishment of Pyrosequencing Assay for Detection of Sudan Ebola Virus

Zhao Yonggang，Zou Yanli ，Zhang Yongqiang，Wu Xiaodong ，Wang Qinghua，Wang Zhiliang
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

［Objective］ To establish a new molecular method for simultaneous and rapid detection and confi rmation of Ebola virus by using sequence analysis combined with pyrosequencing technology. ［Methods］ Amplifi cation primers and a sequencing primer were designed according to the published sequences of conserved L gene regions of three Sudan Ebola viruses in GenBank. A gene sequence was synthesized artifi cially， and the target gene were amplifi ed by PCR， to prepare cRNA through in vitro transcription. RT-PCR was developed for conserved regions of the gene， and the RT-PCR products were pysrosequenced.［Results］ The characterized nucleotide segment was obtained by sequence analysis， and then the segment was confi rmed as Sudan Ebola virus. Compared to the Sanger method of Huada， they showed 100% agreement.［Conclusion］ Pyrosequencing technology based on sequence analysis can be used to confi rm Sudan Ebola virus.

Sudan type EBOV virus；sequence comparison；pyrosequencing

S852.65+9.5

A

1005-944X（2015）09-0077-05