王津津，賈　鵬，史秀杰，于　力，阮周曦，鄭曉聰，何俊強(qiáng)，蘭文升，宋思靜，劉　葒

（深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳　518045）

流式細(xì)胞儀在快速測定鯉春病毒血癥病毒滴度中的應(yīng)用

王津津，賈鵬，史秀杰，于力，阮周曦，鄭曉聰，何俊強(qiáng)，蘭文升，宋思靜，劉葒

（深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳518045）

本研究建立了流式細(xì)胞儀快速檢測鯉春病毒血癥病毒（spring viraemia of carp virus，SVCV）滴度的方法。運(yùn)用熒光激活細(xì)胞分選（fl uorescence-activated cell sorting， FACS）技術(shù)檢測SVCV A1株對草魚性腺細(xì)胞系（GCO）的感染情況。用SVCV病毒單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體為二抗，運(yùn)用FACS來檢測感染后不同時(shí)間點(diǎn)，以及不同病毒接種量的陽性細(xì)胞率。感染第3天時(shí)為最佳的病毒滴度測定時(shí)間點(diǎn)，測得SVCV的病毒滴度為8.31×105FIU/mL，最低檢測病毒滴度為（1000 FIU/mL），與傳統(tǒng)空斑試驗(yàn)（plaque assay，PA）相比，兩種方法測得的結(jié)果基本一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)ACS是一種簡捷、高效、直接的檢測SVCV滴度的方法，是一種新型的病毒滴度測定方法。

鯉春病毒血癥；草魚性腺細(xì)胞系；流式細(xì)胞術(shù)；空斑試驗(yàn)；病毒滴度

鯉春病毒血癥病毒（spring viraemia of carp virus，SVCV）是單鏈負(fù)義RNA病毒，彈狀病毒科［1］，主要感染鯉科魚類，引起鯉科魚類急性、出血性傳染病，在春季大規(guī)模暴發(fā)時(shí)，染病魚類死亡率高達(dá)90%［2］，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為必須申報(bào)疫病之一。

SVCV病毒滴度的經(jīng)典測定方法是空斑試驗(yàn)（plaque assay，PA）［3］，但在實(shí)際操作過程中存在細(xì)胞培養(yǎng)周期長，穩(wěn)定性差，結(jié)果受實(shí)驗(yàn)者主觀影響大等缺點(diǎn)，另一方面對于某些低毒力的SVCV毒株或者組織分離毒株，由于在細(xì)胞里增殖速度慢，造成出斑緩慢甚至不出斑，這個(gè)時(shí)候PA法測定病毒的缺點(diǎn)就更加明顯。為應(yīng)對這種情況，需要建立一種新的病毒滴度的測定方法。隨著熒光激活細(xì)胞分選（FACS）技術(shù)的出現(xiàn)和普及，一種用FACS技術(shù)通過檢測細(xì)胞中病毒抗原來計(jì)算受感染陽性細(xì)胞數(shù)從而確定病毒滴度的方法［4］，目前已經(jīng)廣泛用于對蝦白斑病、傳染性胰臟壞死病毒、流感病毒、狂犬病毒等［5-9］病毒滴度的測定。

SVCV在體外可感染多種細(xì)胞，本試驗(yàn)以感染草魚性腺細(xì)胞系（GCO）為例，運(yùn)用FACS技術(shù)檢測SVCV對GCO細(xì)胞感染量，并與PA法進(jìn)行比較，建立一種快速、直觀的測定SVCV滴度的新方法。

1　材料和方法

1.1病毒、細(xì)胞、 試劑和儀器

病毒為SVCV A1株，由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局鯉春病毒血癥OIE參考實(shí)驗(yàn)室分離；草魚性腺細(xì)胞系（GCO），由中科院（武漢）水生動(dòng)物研究所贈(zèng)送；細(xì)胞培養(yǎng)基采用GIBCO 的M199培養(yǎng)液；胎牛血清購自GIBCO公司；SVCV單克隆抗體購自BIOX公司，使用濃度為1∶200；FITC標(biāo)記的熒光二抗購自Sigma公司，使用濃度為1∶200；流式細(xì)胞儀為BACOMAN公司生產(chǎn)；固定劑和破膜劑購自美國BD公司；甲基纖維素購自Sigma公司，使用時(shí)配置成0.75%溶液；結(jié)晶紫購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，使用時(shí)配置成0.8%溶液；細(xì)胞培養(yǎng)板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶均購自BD公司。

1.2FACS試驗(yàn)測定滴度

將生長狀態(tài)良好的GCO細(xì)胞以1x106的細(xì)胞數(shù)均勻接種于12.5cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%后，將SVCV（A1）株病毒懸液按10倍梯度稀釋至10-6，感染GCO細(xì)胞，室溫孵育1h，然后棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的維持培養(yǎng)基，并設(shè)置不加病毒懸液的陰性對照。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，1500r/min離心5min，棄掉上清，PBS洗2次，加入500μL預(yù)冷的固定液室溫孵育15min，1500r/min離心5min，棄掉上清，PBS洗一次，加入1mL破膜劑室溫孵育10min，離心棄掉上清，加入50μL的anti-SVCV單克隆抗體（1∶200稀釋），室溫孵育1h，離心棄掉上清，PBS洗2次，加入70uL FITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗（PBS 1∶400），室溫避光孵育30min，離心棄掉上清，PBS洗1次，用固定劑1mL重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。根據(jù)文獻(xiàn)［10］采用如下公式計(jì)算FACS滴度：FACS感染單位（FIU/mL）=（陽性細(xì)胞百分率×該孔中的細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)）/每孔接種的病毒量。

1.3病毒空斑試驗(yàn)（PA）測定滴度

根據(jù)參考文獻(xiàn)［11-13］的改良方法，將生長良好的GCO細(xì)胞以每孔1x106的細(xì)胞數(shù)均勻的接種于12.5cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%后，將SVCV A1株病毒懸液按10倍梯度稀釋至10-6感染GCO細(xì)胞，每個(gè)稀釋度設(shè)置2個(gè)平行，每孔100μL；設(shè)置陰性對照，每瓶加入100μL不含血清的M199培養(yǎng)基模擬感染。于20℃吸附1h；棄去病毒液，每瓶加入含有0.75%甲基纖維素和2%胎牛血清的M199培養(yǎng)液4mL，于20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察病毒出斑情況。第3天后，棄去含有甲基纖維素的培養(yǎng)基，并將剩余液體全部吸出，每瓶加入2mL的0.8%結(jié)晶紫溶液，避光染色15min～20min，用流水洗掉結(jié)晶紫溶液，晾干，進(jìn)行空斑計(jì)數(shù)，空斑數(shù)在10～100之間為宜，按下式計(jì)算，空斑滴度（PFU/mL）=（兩稀釋度空斑平均數(shù)/病毒液體積）×稀釋倍數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

FACS和PA法所測的滴度以重復(fù)三次獨(dú)立試驗(yàn)后的均值表示。FACS陽性細(xì)胞百分率以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差X±S表示，不同感染時(shí)間組的FACS陽性細(xì)胞百分率的組間比較采用方差分析，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5FACS法測定滴度與病毒空斑法測定滴度的比較

將病毒空斑法測定的病毒滴度將病毒液作10倍梯度稀釋，共稀釋5個(gè)梯度，然后每個(gè)采用FACS法測定滴度，并用Origin 7.5軟件，對兩種方法的相關(guān)性進(jìn)行直線回歸分析。

2　結(jié)果與分析

2.1SVCV A1株感染GCO后，不同時(shí)間段的FACS結(jié)果

用FACS對未感染組和第1天、第2天、第3天、第4天、第5天感染SVCV A1株的情況進(jìn)行檢測，各組陽性細(xì)胞百分率分別為（0.34±0.03）%、（0.44±0.08）%、（6.06±0.05）%、（36.38±0.42）%、（48.81±1.29）%、（49.04±1.39）%。由圖1可知，隨著時(shí)間的推移陽性細(xì)胞的百分率呈遞增趨勢。

圖1　SVCV A1株感染GCO細(xì)胞后不同時(shí)間的FACS散點(diǎn)圖結(jié)果

圖2　不同稀釋度SVCV感染GCO細(xì)胞的FACS結(jié)果

圖3　FACS滴定法和蝕斑滴定法測定SVCV A1株滴度的結(jié)果比較

收集不同感染時(shí)間點(diǎn)（第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天）細(xì)胞培養(yǎng)液上清，感染正常的GCO細(xì)胞，每天觀察CPE，發(fā)現(xiàn)第1天、第2天和第3天的上清感染細(xì)胞后未出現(xiàn)CPE。而第4天、第5天和第6天的上清感染細(xì)胞后出現(xiàn)明顯的CPE，說明感染第3天以后的上清中已經(jīng)存在感染性的病毒顆粒。以上結(jié)果表明在感染第3天內(nèi)為測定病毒滴度的最佳時(shí)間，超過三天后已經(jīng)有新的病毒粒子包裝完成，釋放到培養(yǎng)上清中，不適合測定初始的病毒原液滴度。

2.2SVCV感染GCO后，不同病毒稀釋度的FACS結(jié)果

對SVCV A1株病毒原液進(jìn)行10倍的梯度稀釋，然后感染GCO細(xì)胞，并在第3天檢測FACS滴度，由圖2可知，隨著病毒稀釋度的增加，F(xiàn)ACS能夠檢測到的陽性細(xì)胞百分率呈遞減趨勢。采用1.2中的滴度計(jì)算公式計(jì)算得FACS法測定的SVCV A1株感染GCO細(xì)胞的滴度為8.31×105FIU/mL。

2.3病毒空斑法檢測SVCV滴度

經(jīng)結(jié)晶紫染色后，可見透明空斑，邊緣清晰。計(jì)數(shù)空斑數(shù)量，采用1.3中的滴度計(jì)算公式計(jì)算得SVCV的空斑滴度為3.9×105PFU/mL。

2.4FACS法測滴度與病毒空斑法測滴度的比較

FACS的陽性百分率及其FIU與病毒的PFU之間存在線性對應(yīng)關(guān)系（圖3）。比較發(fā)現(xiàn)兩種方法的精密性基本一致，都可以用來表達(dá)病毒感染細(xì)胞的滴度。從試驗(yàn)測定的數(shù)值來看，F(xiàn)ACS法測定SVCV滴度的下限為每毫升病毒液1000個(gè)感染單位，而病毒空斑法測得的SVCV滴度的下限為390 PFU/mL。

3　討論

病毒滴度測定是進(jìn)行病毒學(xué)試驗(yàn)和研究的第一步，每一種病毒滴度測定的方法都是對病毒感染力的相對定量，根據(jù)不同的病毒特性要選擇不同的滴度測定方法。

FACS法是通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中病毒抗原來計(jì)算受感染陽性細(xì)胞數(shù)，從而確定病毒滴度的方法。本試驗(yàn)運(yùn)用FACS法，對SVCV A1株感染GCO細(xì)胞不同時(shí)間段的細(xì)胞感染數(shù)進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移感染病毒的陽性細(xì)胞的百分率呈遞增趨勢。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)SVCV感染GCO細(xì)胞后的3天內(nèi)為測定病毒滴度的最佳時(shí)間，超過三天后已經(jīng)有新的病毒粒子包裝完成，釋放到培養(yǎng)上清中，不適合測定初始的病毒原液滴度。同時(shí)，用不同稀釋度的病毒感染GCO細(xì)胞，在第3天測定感染病毒的細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)，隨著病毒稀釋度的增加，F(xiàn)ACS能夠檢測到的陽性細(xì)胞的百分率呈遞減趨勢。最終，通過FACS法，測得SVCV A1株的滴度為8.31×105FIU/mL。

空斑法（PA）是測定SVCV滴度的經(jīng)典方法［14］，PA通過計(jì)數(shù)病毒形成的空斑單位可以直觀的計(jì)算出病毒滴定，這種方法能真實(shí)反映病毒的毒力強(qiáng)弱。本實(shí)驗(yàn)對SVCV A1株進(jìn)行了PA法滴定，測得滴度為3.9×105PFU/mL。

通過比較FACS法測定的SVCV A1株的滴度和PA法測得的滴度，發(fā)現(xiàn)兩種方法成良好的線性關(guān)系，結(jié)果是一致的。說明FACS法是一種較好的病毒感染力研究方法。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)FACS法的最低檢測量為每毫升1000個(gè)感染單位，低于PA法的最低檢測線每毫升390 PFU，說明FACS法的靈敏性低于PA法。但是PA法存在一些難點(diǎn)和缺點(diǎn)，例如PA法測定病毒滴度時(shí)，需要病毒粒子在細(xì)胞內(nèi)組裝完成，再從一個(gè)細(xì)胞感染至另一個(gè)細(xì)胞，出現(xiàn)CPE時(shí)，才能進(jìn)行滴度測定，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期較長，而且在空斑未形成之前細(xì)胞容易死亡，對于某些毒力較弱的毒株或者組織分離毒株，容易出現(xiàn)出斑慢甚至不出斑的情況，試驗(yàn)重復(fù)性差，覆蓋物制備復(fù)雜等。這些缺點(diǎn)限制了PA法的應(yīng)用［15］。而FACS法不需要依賴于病毒感染細(xì)胞而出現(xiàn)的CPE來判斷病毒感染情況，它可以在24小時(shí)內(nèi)檢測到病毒的感染。正好彌補(bǔ)了PA法測定滴度的不足。

FACS法測定病毒滴度的技術(shù)優(yōu)勢可以有效的滴定不易產(chǎn)生CPE或者不易出現(xiàn)空斑的弱毒株和組織分離毒株，而且不受操作者主觀因素影響［16-17］。這在病毒的早期感染診斷中具有重要意義。本文通過實(shí)驗(yàn)研究表明，F(xiàn)ACS法是一種簡捷、高效、直接的測定病毒滴度的新方法。

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（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Flow Cytometry Assay for Titrating Spring Viraemia of Carp Virus

Wang Jinjin，Jia Peng，Shi Xiujie，Yu Li，Ruan Zhouxi，Zheng Xiaocong，He Junqiang，Lan Wensheng，Song Sijing，Liu Hong
（Shenzhen Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518045）

A fl ow cytometry assay was established for rapid titrating spring viraemia of carp virus（SVCV）. Fluorescence-activated cell sorting（FACS） was used to detect SVCV A1 strain-infected GCO cells. The infected cells reacted with anti-SVC monoclonal antibody before being covered with labeled fl uorescein-anti-mouse immunoglobulin. FACS was used to analyze the percentage of infected cells at different time points and different virus infections. The results demonstrate that day 3 was the best time to titer SVCV. The titers of SVCV A1 strain was 8.31×105FIU/mL. The lowest limit of detection by FACS was 1000 infectious units per milliliter of inoculum. Comparing the titers of SVCV A1 strain with FACS and plaque assay，similar titers were obtained with the two assays. The novel FACS is recommended as a simple， effi cient and direct assay for titrating SVCV and other virus.

spring viraemia of carp virus；grass carp ovary cell line；fl ow cytometry；plaque assay；virus titer

S941.41+6

B

1005-944X（2015）09-0082-05

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014IK236）、國家質(zhì)檢總局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201210055和20120214）、深圳檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（SZ2014202）通訊作者：劉 葒