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      基于巰基—烯烴點擊化學(xué)的聚丙烯酰胺型親水作用色譜固定相的制備

      2015-11-03 06:59楊鐸等
      分析化學(xué) 2015年10期

      楊鐸等

      摘 要 采用巰基-烯烴點擊反應(yīng)制備了一種新型聚丙烯酰胺鍵合烯基修飾硅膠的親水色譜固定相。丙烯酰胺與二硫代苯甲酸芐酯通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)反應(yīng)合成聚合物。在甲苯中,3-異氰酸酯丙基三甲氧基硅烷、丙烯胺和吡啶反應(yīng)后,再與硅膠反應(yīng)制備烯基修飾硅膠(EUS)。在甲醇中,以2,2-偶氮二異丁基脒鹽酸鹽為引發(fā)劑,被硼氫化鈉還原的聚丙烯酰胺與EUS于55℃反應(yīng)48 h,鍵合上巰基活化的聚合物。利用元素分析和紅外光譜的方法對固定相TE-UPAM(Thiol-ene urea polyacy (amide))進行表征,含碳量與EUS相比有所增加,在1636和1570 cm-1處存在多重酰胺鍵紅外特征峰??疾炝肆鲃酉嘀兴俊Ⅺ}濃度和pH值的變化對極性化合物保留時間的影響。結(jié)果表明,保留時間隨水含量的增加而減??; 中性和堿性化合物保留時間隨鹽濃度的增大而延長,在pH 3.3~4.8范圍內(nèi),堿性化合物的保留時間隨pH的降低而縮短,均與酸性化合物相反。固定相TE-UPAM在親水模式下與傳統(tǒng)硅膠固定相比較,更好地分離了7種核苷和堿基,再通過對寡糖的分離,表明此固定相分離極性化合物的巨大潛力。

      關(guān)鍵詞 可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移; 聚丙烯酰胺; 巰基-烯烴點擊化學(xué); 親水作用色譜

      1 引 言

      親水作用色譜(Hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)作為一種分離極性化合物的液相色譜模式,最早由Alpert于1990年提出[1],主要特征是使用類似于正相色譜的極性固定相和水/有機溶劑(通常是乙腈)的流動相。HILIC固定相的鍵合相為親水性的極性基團。隨著HILIC的快速發(fā)展,其固定相也日益豐富。其中,一類為小分子鍵合相,如二醇基、氰基、氨基、酰胺、半胱氨酸、麥芽糖等[2~5]; 另一類為聚合物鍵合相,如聚琥珀酰亞胺型PolyHydroxyethyl A,PolyCAT A和PolySulfoethyl A等[6],聚磷酸膽堿型KS-polyMPC[7]和聚甜菜堿型[8]。目前,制備聚合物鍵合相主要有“從表面接枝(Grafting from)”和“接枝到(Grafting to)”兩種方法?!皬谋砻娼又Α狈椒╗9]是將反應(yīng)活性種以化學(xué)鍵的形式接枝到基體表面,然后在表面引發(fā)單體接枝聚合。該方法中分子體積小,易擴散至基體表面發(fā)生鏈增長反應(yīng),鍵合密度高,但得到聚合物的分子量分布較寬,均勻性差?!敖又Φ健狈椒╗10]是將預(yù)合成的聚合物通過具有反應(yīng)活性的末基或側(cè)基與功能化表面的化學(xué)反應(yīng)接枝到基體表面。該方法可較容易地控制聚合物的分子量及其分布,鍵合相有較好的規(guī)整度,但由于分子體積較大,存在空間位阻效應(yīng),使鍵合效率較低,鍵合量受限。因此,需要高效反應(yīng)來解決該問題。

      2001年,Sharpless首次提出點擊化學(xué)(Click chemistry)[11]的概念。Thiol-ene點擊反應(yīng)[11~13]與傳統(tǒng)的疊氮-炔基點擊反應(yīng)[11,14]相比,具有無金屬催化、反應(yīng)效率高、操作簡單、條件溫和等優(yōu)點。近年來,Thiol-ene在高分子化學(xué)、生物學(xué)和有機化學(xué)中的應(yīng)用越來越廣泛[15]。

      本研究采用Thiol-ene點擊化學(xué)方法,將親水性的聚丙烯酰胺“接枝到”烯基修飾的硅膠表面,制備了一種HILIC固定相,在親水色譜模式下進行評價和應(yīng)用研究。通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(Reversible addition-fragmentation chain transfer, RAFT)反應(yīng)[11]合成聚丙烯酰胺。RAFT是Rizzardo于1998年提出的一種可控活性自由基聚合方法,可以有效控制聚合物分子量及其分布。本研究中,RAFT試劑引入的硫代酯被硼氫化鈉還原成巰基[15],與硅膠表面的烯基發(fā)生Thiol-ene反應(yīng),實現(xiàn)聚丙烯酰胺的表面鍵合,使RAFT與Thiol-ene很好地結(jié)合。通過元素分析和紅外光譜的方法表征,采用一系列極性化合物評價色譜性能,并選用堿基、核苷和寡糖探究TE-UPAM的應(yīng)用潛力。

      2 實驗部分

      2.1 儀器與試劑

      材料表征所用儀器包括Nicolet 20 DXB紅外光譜儀(Madison, WI, USA),Vario EL III 元素分析儀(Elementar, Germany),Bruker DSX 300 核磁共振儀(300 MHz, 7.0 T, Karlsruhe, Germany)和Malvern Zetasizer Nano-ZS90電位測定儀(Malvern, UK)。

      色譜評價所用儀器為Waters 2695高效液相色譜儀,包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、2996型光電二極管陣列檢測器和2424蒸發(fā)光散射檢測器,Empower色譜工作站(美國Waters公司); KQ5200DE超聲儀(江蘇昆山有限公司)。

      實驗所用試劑包括乙腈和甲醇(色譜純,美國JTBaker公司); 甲酸和甲酸銨(分析純,百靈威科技有限公司); 實驗用水來自Milli-Q純水凈化系統(tǒng)(Billerica, MA, USA); 無水四氫呋喃、苯基溴化鎂、二硫化碳、溴芐、丙烯酰胺、2,2-偶氮二異丁腈(Azodiisobulyronitrile, AIBN)、2,2-偶氮二異丁基脒鹽酸鹽(2,2′-azobis[20methylpropionamidine]dihydro chloride, AIBA)均為分析純(上海阿拉丁試劑有限公司); 硅膠(5 μm,300 ,富士硅化學(xué)公司); 無水硫酸鈉、氯化鈉、硼氫化鈉(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司); 丙炔胺(分析純,美國Acros公司); 3-異氰酸酯丙基三甲氧基硅烷(分析純,上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司); 正己烷、1,4-二氧六環(huán)、甲苯、吡啶、鹽酸、乙醚以及核苷、寡糖等樣品均為分析純(Sigma-Aldrich公司)。

      2.2 實驗方法

      2.2.1 二硫代苯甲酸芐酯的合成 在無水無氧條件下,向200 mL無水四氫呋喃中加入163.6 mL苯基溴化鎂,升溫至40℃,滴加32.8 mL二硫化碳,攪拌5 min,滴加32.8 mL溴芐,升溫至50℃,攪拌24 h,合成路線見圖1[17]。收集產(chǎn)物(RAFT試劑)31.6 g,產(chǎn)率79%,1H NMR數(shù)據(jù)為δ 4.60(2H,s)歸屬于芐基上氫,δ 7.20~7.50(8H,m)為苯環(huán)鄰間位氫,δ 8.02(2H,m)為苯環(huán)對位氫。

      2.2.2 表面烯基修飾硅膠的合成 將3 mL 3-異氰酸酯丙基三甲氧基硅烷、2 mL丙烯胺和1 mL吡啶加入40 mL甲苯中,攪拌,氮氣氛圍下升溫至80℃,反應(yīng)12 h。加入10.4 g硅膠,升溫至110℃,反應(yīng)12 h即得烯基修飾硅膠(圖2),命名為EUS(E-烯基,U-脲基,S-硅膠)。

      2.2.3 聚丙烯酰胺的合成 丙烯酰胺單體64 g,二硫代苯甲酸芐酯4.32 g和AIBN 1.44 g加入到180 mL 1,4-二氧六環(huán)/甲醇(4∶1, V/V)中,氮氣下攪拌,升溫至65℃,36 h后得聚丙烯酰胺4.44 g[18]。1H NMR數(shù)據(jù)為δ 7.15~7.30(4H,m)歸屬于為苯環(huán)間鄰位氫,7.42(H,m)為苯環(huán)對位氫,7.60~7.90為酰胺活潑氫。通過凝膠滲透色譜法(Gel-permeation chromatography, GPC)測定結(jié)果為數(shù)均分子量(Mn)為2200 g/mol, 重均分子量(Mw)為2500 g/mol,多分散性系數(shù)(Mw/Mn)為1.24。

      2.2.4 固定相TE-UPAM的合成 3 g聚丙烯酰胺溶于20 mL水,氮氣下攪拌,加入0.35 g NaBH4 ,升溫至65℃,反應(yīng)12 h[16]。調(diào)至pH 7,加入10 g EUS,0.3 g AIBA,30 mL甲醇和10 mL水,降至55℃,反應(yīng)48 h,得固定相TE-UPAM(TE-thiol-ene,U-脲基,PAM-聚丙烯酰胺),見圖3。

      2.3 色譜柱的填裝及色譜條件

      色譜柱(150 mm × 4.6 mm); 裝柱壓力:25 MPa,勻漿液和頂替液:甲醇。

      色譜條件:流動相為乙腈/水/緩沖鹽的體系,緩沖鹽為100 mmol/L或200 mmol/L甲酸銨,pH分別為6.2, 4.8和3.3,柱溫:30℃,流速:1.0 mL/min,檢測波長:270 nm。死時間使用甲醇測定,為1.70 min。

      3 結(jié)果與討論

      3.1 固定相TE-UPAM的合成與表征

      對EUS和TE-UPAM進行元素分析,含碳量分別為3.722%和4.378%,表明聚丙烯酰胺成功鍵合。按照文獻\[19\]提供的方法計算,烯基鍵合量為1.58 μmol/m2,聚丙烯酰胺鍵合量為0.15 μmol/m2。

      采用傅立葉變換紅外光譜對EUS和TE-UPAM進行表征(圖4),1100和3439 cm-1分別為SiμOμSi[20]和OμH的伸縮振動峰。在1636和1570 cm-1處存在多重酰胺鍵的紅外特征峰,說明聚丙烯酰胺成功鍵合。

      3.2 固定相TE-UPAM的基本色譜性能評價

      3.2.1 流動相中水含量對保留行為的影響 在HILIC模式下,考察流動相中不同水含量對化合物保留行為的影響。選取尿嘧啶、尿苷、胞嘧啶、胞苷、乳清酸進行評價。圖5表明,保留時間隨水含量增加而縮短,這種變化趨勢符合HILIC模式下色譜保留行為特征[1],故可作為HILIC固定相。

      3.2.2 緩沖溶液對保留行為的影響 在HILIC模式下緩沖鹽對溶質(zhì)的保留行為具有顯著影響,因此,一般都要使用一定濃度的緩沖溶液作為添加劑[1,21]。流動相中乙腈含量為90%,選取酸性的乳清酸和水楊酸、中性的尿苷以及堿性的普萘洛爾和胞嘧啶,考察了不同濃度的甲酸銨(5、10和15 mmol/L)對化合物保留行為的影響(圖6)。尿苷保留時間隨甲酸銨濃度增大而延長,這符合Alpert提出的HILIC分配機理[19],即鹽濃度增大導(dǎo)致固定相表面“富水層”增厚,使溶質(zhì)的分配增加,延長保留時間[21,22]; 堿性化合物的保留時間隨甲酸銨濃度增大而增加,符合HILIC分配機理,但也與電荷排斥的保留行為類似,即堿性化合物與固定相互相排斥; 乳清酸和水楊酸的保留時間隨甲酸銨濃度增大而減小,不符合HILIC分配機理,但與離子交換色譜的保留行為[22,23]類似,即酸性化合物與固定相互相吸引,因此推測固定相表面可能存在正電荷。

      考察不同pH值的甲酸銨對溶質(zhì)保留時間的影響。乙腈含量為90%,甲酸銨的pH分別為6.2, 4.8和3.3,濃度10 mmol/L,結(jié)果見圖7。pH值對中性的尿苷保留時間影響很小,說明核苷的保留以HILIC分配作用為主[22]。pH 4.8~6.2,酸性和堿性化合物的保留時間不變,但pH 3.3~4.8,酸性化合物的保留時間隨pH降低而延長,堿性化合物則相反 [24]。

      通過Ζeta電位測定表面電荷情況(表1),結(jié)果表明,表面存在少量正電荷,并隨pH值降低而減少,與上述推測相符。正電荷可能來自殘留的吡啶[25],也可能來自少量脲基或酰胺水解生成的氨基??傊?,電荷是微弱的,可以使用緩沖鹽抑制。

      3.3 固定相TE-UPAM在HILIC模式下的應(yīng)用

      選取核苷和堿基對TE-UPAM進行應(yīng)用評價。核苷和堿基具有很強的親水性,在反相色譜柱上很難保留。但與硅膠固定相比,在TE-UPAM上保留更強,分離效果更好,見圖8。

      進一步選用寡糖(β-1,4-低聚半乳糖[26])進行應(yīng)用評價,由圖9可見,分離效果很好。

      4 結(jié) 論

      利用Thiol-ene點擊化學(xué)方法,將強親水性的聚丙烯酰胺“接枝到”EUS表面上,制備了一種HILIC固定相TE-UPAM。聚丙烯酰胺是通過RAFT聚合和硼氫化鈉還原成末端巰基活化的聚合物。EUS增加了連接臂,降低了空間位阻,提高了鍵合效率。元素分析和紅外光譜分析表明, 聚丙烯酰胺成功鍵合。采用極性化合物評價,說明此固定相具有典型的HILIC保留特性; 進一步利用核苷、堿基和寡糖的應(yīng)用評價表明,固定相TE-UPAM在極性化合物分離中具有較好的應(yīng)用潛力。

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