楊鐸等

摘 要 采用巰基-烯烴點擊反應(yīng)制備了一種新型聚丙烯酰胺鍵合烯基修飾硅膠的親水色譜固定相。丙烯酰胺與二硫代苯甲酸芐酯通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）反應(yīng)合成聚合物。在甲苯中，3-異氰酸酯丙基三甲氧基硅烷、丙烯胺和吡啶反應(yīng)后，再與硅膠反應(yīng)制備烯基修飾硅膠（EUS）。在甲醇中，以2，2-偶氮二異丁基脒鹽酸鹽為引發(fā)劑，被硼氫化鈉還原的聚丙烯酰胺與EUS于55℃反應(yīng)48 h，鍵合上巰基活化的聚合物。利用元素分析和紅外光譜的方法對固定相TE-UPAM（Thiol-ene urea polyacy （amide））進行表征，含碳量與EUS相比有所增加，在1636和1570 cm^-1處存在多重酰胺鍵紅外特征峰?？疾炝肆鲃酉嘀兴俊Ⅺ}濃度和pH值的變化對極性化合物保留時間的影響。結(jié)果表明，保留時間隨水含量的增加而減??； 中性和堿性化合物保留時間隨鹽濃度的增大而延長，在pH 3.3～4.8范圍內(nèi)，堿性化合物的保留時間隨pH的降低而縮短，均與酸性化合物相反。固定相TE-UPAM在親水模式下與傳統(tǒng)硅膠固定相比較，更好地分離了7種核苷和堿基，再通過對寡糖的分離，表明此固定相分離極性化合物的巨大潛力。

關(guān)鍵詞 可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移； 聚丙烯酰胺； 巰基-烯烴點擊化學(xué)； 親水作用色譜

1 引 言

親水作用色譜（Hydrophilic interaction liquid chromatography， HILIC）作為一種分離極性化合物的液相色譜模式，最早由Alpert于1990年提出[1]，主要特征是使用類似于正相色譜的極性固定相和水/有機溶劑（通常是乙腈）的流動相。HILIC固定相的鍵合相為親水性的極性基團。隨著HILIC的快速發(fā)展，其固定相也日益豐富。其中，一類為小分子鍵合相，如二醇基、氰基、氨基、酰胺、半胱氨酸、麥芽糖等[2～5]； 另一類為聚合物鍵合相，如聚琥珀酰亞胺型PolyHydroxyethyl A，PolyCAT A和PolySulfoethyl A等[6]，聚磷酸膽堿型KS-polyMPC[7]和聚甜菜堿型[8]。目前，制備聚合物鍵合相主要有“從表面接枝（Grafting from）”和“接枝到（Grafting to）”兩種方法?！皬谋砻娼又Α狈椒╗9]是將反應(yīng)活性種以化學(xué)鍵的形式接枝到基體表面，然后在表面引發(fā)單體接枝聚合。該方法中分子體積小，易擴散至基體表面發(fā)生鏈增長反應(yīng)，鍵合密度高，但得到聚合物的分子量分布較寬，均勻性差?！敖又Φ健狈椒╗10]是將預(yù)合成的聚合物通過具有反應(yīng)活性的末基或側(cè)基與功能化表面的化學(xué)反應(yīng)接枝到基體表面。該方法可較容易地控制聚合物的分子量及其分布，鍵合相有較好的規(guī)整度，但由于分子體積較大，存在空間位阻效應(yīng)，使鍵合效率較低，鍵合量受限。因此，需要高效反應(yīng)來解決該問題。

2001年，Sharpless首次提出點擊化學(xué)（Click chemistry）[11]的概念。Thiol-ene點擊反應(yīng)[11～13]與傳統(tǒng)的疊氮-炔基點擊反應(yīng)[11，14]相比，具有無金屬催化、反應(yīng)效率高、操作簡單、條件溫和等優(yōu)點。近年來，Thiol-ene在高分子化學(xué)、生物學(xué)和有機化學(xué)中的應(yīng)用越來越廣泛[15]。

本研究采用Thiol-ene點擊化學(xué)方法，將親水性的聚丙烯酰胺“接枝到”烯基修飾的硅膠表面，制備了一種HILIC固定相，在親水色譜模式下進行評價和應(yīng)用研究。通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（Reversible addition-fragmentation chain transfer， RAFT）反應(yīng)[11]合成聚丙烯酰胺。RAFT是Rizzardo于1998年提出的一種可控活性自由基聚合方法，可以有效控制聚合物分子量及其分布。本研究中，RAFT試劑引入的硫代酯被硼氫化鈉還原成巰基[15]，與硅膠表面的烯基發(fā)生Thiol-ene反應(yīng)，實現(xiàn)聚丙烯酰胺的表面鍵合，使RAFT與Thiol-ene很好地結(jié)合。通過元素分析和紅外光譜的方法表征，采用一系列極性化合物評價色譜性能，并選用堿基、核苷和寡糖探究TE-UPAM的應(yīng)用潛力。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

材料表征所用儀器包括Nicolet 20 DXB紅外光譜儀（Madison， WI， USA），Vario EL III 元素分析儀（Elementar， Germany），Bruker DSX 300 核磁共振儀（300 MHz， 7.0 T， Karlsruhe， Germany）和Malvern Zetasizer Nano-ZS90電位測定儀（Malvern， UK）。

色譜評價所用儀器為Waters 2695高效液相色譜儀，包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、2996型光電二極管陣列檢測器和2424蒸發(fā)光散射檢測器，Empower色譜工作站（美國Waters公司）； KQ5200DE超聲儀（江蘇昆山有限公司）。

實驗所用試劑包括乙腈和甲醇（色譜純，美國JTBaker公司）； 甲酸和甲酸銨（分析純，百靈威科技有限公司）； 實驗用水來自Milli-Q純水凈化系統(tǒng)（Billerica， MA， USA）； 無水四氫呋喃、苯基溴化鎂、二硫化碳、溴芐、丙烯酰胺、2，2-偶氮二異丁腈（Azodiisobulyronitrile， AIBN）、2，2-偶氮二異丁基脒鹽酸鹽（2，2′-azobis[20methylpropionamidine]dihydro chloride， AIBA）均為分析純（上海阿拉丁試劑有限公司）； 硅膠（5 μm，300 ，富士硅化學(xué)公司）； 無水硫酸鈉、氯化鈉、硼氫化鈉（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）； 丙炔胺（分析純，美國Acros公司）； 3-異氰酸酯丙基三甲氧基硅烷（分析純，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）； 正己烷、1，4-二氧六環(huán)、甲苯、吡啶、鹽酸、乙醚以及核苷、寡糖等樣品均為分析純（Sigma-Aldrich公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 二硫代苯甲酸芐酯的合成 在無水無氧條件下，向200 mL無水四氫呋喃中加入163.6 mL苯基溴化鎂，升溫至40℃，滴加32.8 mL二硫化碳，攪拌5 min，滴加32.8 mL溴芐，升溫至50℃，攪拌24 h，合成路線見圖1[17]。收集產(chǎn)物（RAFT試劑）31.6 g，產(chǎn)率79%，1H NMR數(shù)據(jù)為δ 4.60（2H，s）歸屬于芐基上氫，δ 7.20～7.50（8H，m）為苯環(huán)鄰間位氫，δ 8.02（2H，m）為苯環(huán)對位氫。

2.2.2 表面烯基修飾硅膠的合成 將3 mL 3-異氰酸酯丙基三甲氧基硅烷、2 mL丙烯胺和1 mL吡啶加入40 mL甲苯中，攪拌，氮氣氛圍下升溫至80℃，反應(yīng)12 h。加入10.4 g硅膠，升溫至110℃，反應(yīng)12 h即得烯基修飾硅膠（圖2），命名為EUS（E-烯基，U-脲基，S-硅膠）。

2.2.3 聚丙烯酰胺的合成 丙烯酰胺單體64 g，二硫代苯甲酸芐酯4.32 g和AIBN 1.44 g加入到180 mL 1，4-二氧六環(huán)/甲醇（4∶1， V/V）中，氮氣下攪拌，升溫至65℃，36 h后得聚丙烯酰胺4.44 g[18]。1H NMR數(shù)據(jù)為δ 7.15～7.30（4H，m）歸屬于為苯環(huán)間鄰位氫，7.42（H，m）為苯環(huán)對位氫，7.60～7.90為酰胺活潑氫。通過凝膠滲透色譜法（Gel-permeation chromatography， GPC）測定結(jié)果為數(shù)均分子量（Mn）為2200 g/mol， 重均分子量（Mw）為2500 g/mol，多分散性系數(shù)（Mw/Mn）為1.24。

2.2.4 固定相TE-UPAM的合成 3 g聚丙烯酰胺溶于20 mL水，氮氣下攪拌，加入0.35 g NaBH4 ，升溫至65℃，反應(yīng)12 h[16]。調(diào)至pH 7，加入10 g EUS，0.3 g AIBA，30 mL甲醇和10 mL水，降至55℃，反應(yīng)48 h，得固定相TE-UPAM（TE-thiol-ene，U-脲基，PAM-聚丙烯酰胺），見圖3。

2.3 色譜柱的填裝及色譜條件

色譜柱（150 mm × 4.6 mm）； 裝柱壓力：25 MPa，勻漿液和頂替液：甲醇。

色譜條件：流動相為乙腈/水/緩沖鹽的體系，緩沖鹽為100 mmol/L或200 mmol/L甲酸銨，pH分別為6.2， 4.8和3.3，柱溫：30℃，流速：1.0 mL/min，檢測波長：270 nm。死時間使用甲醇測定，為1.70 min。

3 結(jié)果與討論

3.1 固定相TE-UPAM的合成與表征

對EUS和TE-UPAM進行元素分析，含碳量分別為3.722%和4.378%，表明聚丙烯酰胺成功鍵合。按照文獻＼[19＼]提供的方法計算，烯基鍵合量為1.58 μmol/m2，聚丙烯酰胺鍵合量為0.15 μmol/m2。

采用傅立葉變換紅外光譜對EUS和TE-UPAM進行表征（圖4），1100和3439 cm^-1分別為SiμOμSi[20]和OμH的伸縮振動峰。在1636和1570 cm^-1處存在多重酰胺鍵的紅外特征峰，說明聚丙烯酰胺成功鍵合。

3.2 固定相TE-UPAM的基本色譜性能評價

3.2.1 流動相中水含量對保留行為的影響 在HILIC模式下，考察流動相中不同水含量對化合物保留行為的影響。選取尿嘧啶、尿苷、胞嘧啶、胞苷、乳清酸進行評價。圖5表明，保留時間隨水含量增加而縮短，這種變化趨勢符合HILIC模式下色譜保留行為特征[1]，故可作為HILIC固定相。

3.2.2 緩沖溶液對保留行為的影響 在HILIC模式下緩沖鹽對溶質(zhì)的保留行為具有顯著影響，因此，一般都要使用一定濃度的緩沖溶液作為添加劑[1，21]。流動相中乙腈含量為90%，選取酸性的乳清酸和水楊酸、中性的尿苷以及堿性的普萘洛爾和胞嘧啶，考察了不同濃度的甲酸銨（5、10和15 mmol/L）對化合物保留行為的影響（圖6）。尿苷保留時間隨甲酸銨濃度增大而延長，這符合Alpert提出的HILIC分配機理[19]，即鹽濃度增大導(dǎo)致固定相表面“富水層”增厚，使溶質(zhì)的分配增加，延長保留時間[21，22]； 堿性化合物的保留時間隨甲酸銨濃度增大而增加，符合HILIC分配機理，但也與電荷排斥的保留行為類似，即堿性化合物與固定相互相排斥； 乳清酸和水楊酸的保留時間隨甲酸銨濃度增大而減小，不符合HILIC分配機理，但與離子交換色譜的保留行為[22，23]類似，即酸性化合物與固定相互相吸引，因此推測固定相表面可能存在正電荷。

考察不同pH值的甲酸銨對溶質(zhì)保留時間的影響。乙腈含量為90%，甲酸銨的pH分別為6.2， 4.8和3.3，濃度10 mmol/L，結(jié)果見圖7。pH值對中性的尿苷保留時間影響很小，說明核苷的保留以HILIC分配作用為主[22]。pH 4.8～6.2，酸性和堿性化合物的保留時間不變，但pH 3.3～4.8，酸性化合物的保留時間隨pH降低而延長，堿性化合物則相反 [24]。

通過Ζeta電位測定表面電荷情況（表1），結(jié)果表明，表面存在少量正電荷，并隨pH值降低而減少，與上述推測相符。正電荷可能來自殘留的吡啶[25]，也可能來自少量脲基或酰胺水解生成的氨基?？傊?，電荷是微弱的，可以使用緩沖鹽抑制。

3.3 固定相TE-UPAM在HILIC模式下的應(yīng)用

選取核苷和堿基對TE-UPAM進行應(yīng)用評價。核苷和堿基具有很強的親水性，在反相色譜柱上很難保留。但與硅膠固定相比，在TE-UPAM上保留更強，分離效果更好，見圖8。

進一步選用寡糖（β-1，4-低聚半乳糖[26]）進行應(yīng)用評價，由圖9可見，分離效果很好。

4 結(jié) 論

利用Thiol-ene點擊化學(xué)方法，將強親水性的聚丙烯酰胺“接枝到”EUS表面上，制備了一種HILIC固定相TE-UPAM。聚丙烯酰胺是通過RAFT聚合和硼氫化鈉還原成末端巰基活化的聚合物。EUS增加了連接臂，降低了空間位阻，提高了鍵合效率。元素分析和紅外光譜分析表明， 聚丙烯酰胺成功鍵合。采用極性化合物評價，說明此固定相具有典型的HILIC保留特性； 進一步利用核苷、堿基和寡糖的應(yīng)用評價表明，固定相TE-UPAM在極性化合物分離中具有較好的應(yīng)用潛力。

References

1 Alpert A J. J. Chromatogr.， 1990， 499： 177-196

2 SHEN Ai-Jin， GUO Zhi-Mou， LIANG Xin-Miao. Progress in Chemistry， 2014， 26（1）： 10-18

沈愛金， 郭志謀， 梁鑫淼. 化學(xué)進展， 2014， 26（1）： 10-18

3 Shen A J， Guo Z M， Yu L， Cao L， Liang X M. Chem. Commun.， 2011， 47（15）： 4550-4552

4 WANG Fu-Qiang， CHANG Su-Ping， DAI Xiao-Jun， GONG Bo-Lin. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（3）： 415-420

王富強， 常素萍， 戴小軍， 龔波林. 分析化學(xué)， 2012， 40（3）： 415-420

5 Guo Z M， Lei A W， Liang X M， Xu Q. Chem. Commun.， 2006， （43）： 4512-4514

6 Zhu B Y， Mant C T， Hodges R S. J. Chromatogr.， 1991， 548（1-2）： 13-24

7 Jiang W， Fischer G， Girmay Y， Irgum K. J. Chromatogr. A， 2006， 1127（1-2）： 82-91

8 Jiang W， Irgum K. Anal. Chem.， 2001， 73（9）： 1993-2003

9 Prucker O， Ruhe J. Macromolecules， 1998， 31（3）： 602-613

10 Yoshikawa S， Tsubokawa N. Polym. J.， 1996， 28（4）： 317-322

11 Kolb H C， Finn M G， Sharpless K B. Angew. Chem. Inter. Ed.， 2001， 40（11）： 2004-2021

12 van Dijk M， Rijkers D T S， Liskamp R M J， van Nostrum C F， Hennink W E. Bioconjugate Chem.， 2009， 20（11）： 2001-2016

13 Hoyle C E， Bowman C N. Angew. Chem. Inter. Ed.， 2010， 49（9）： 1540-1573

14 Rostovtsev V V， Green L G， Fokin V V， Sharpless K B. Angew. Chem. Inter. Ed.， 2002， 41（14）： 2596-2599

15 Povie G， Tran A T， Bonnaffe D， Habegger J， Hu Z Y， Le Narvor C， Renaud P. Angew. Chem. Inter. Ed.， 2014， 53（15）： 3894-3898

16 Lowe A B， Sumerlin B S， Donovan M S， McCormick C L. J. Am. Chem. Soc.， 2002， 124（39）： 11562-11563

17 ZHOU Xiao-Jing， YUAN Fu-Gen. Journal of Suzhou University of Science and Technology Natural Science， 2009， 2（26）： 60-63

周曉靜， 袁福根. 蘇州科技學(xué)院學(xué)報， 2009， 2（26）： 60-63

18 Zhang M X， Qing G Y， Xiong C L， Cui R， Pang D W， Sun T L. Adv. Mater.， 2013， 25（5）： 749-754

19 Kibbey C E， Meyerhoff M E. Anal. Chem.， 1993， 65（17）： 2189-2196

20 Yu P， Kirkpatrick R J， Poe B， McMillan P F， Cong X D. J. Am. Ceram. Soc.， 1999， 82（3）： 742-748

21 Hemstrom P， Irgum K. J. Sep. Sci.， 2006， 29（12）： 1784-1821

22 Guo Y， Gaiki S. J. Chromatogr. A， 2005， 1074（1-2）： 71-80

23 Olsen B A. J. Chromatogr. A， 2001， 913（1-2）： 113-122

24 Alpert A J. Anal. Chem.， 2008， 80（1）： 62-76

25 YAO Zi-Peng， CAI Zhi-Ming. Chemistry， 1996， 6： 53-54

姚子鵬， 蔡志明. 化學(xué)通報， 1996， 6： 53-54

26 Fu Q， Liang T， Zhang X L， Du Y G， Guo Z M， Liang X M. Carbohydr. Res.， 2010， 345（18）： 2690-2697