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      高濃度酶快速膠內酶解技術用于磷酸化蛋白質組學分析

      2015-11-03 07:04劉芳等
      分析化學 2015年10期

      劉芳等

      摘 要 聚丙烯酰胺凝膠電泳是一項高效的蛋白質分離技術,通過與質譜技術聯(lián)用,可以鑒定成千上萬的蛋白質點。但是,復雜繁瑣的操作流程限制了它在蛋白質組學研究方面的廣泛應用。本研究表明,高濃度的胰蛋白酶并不會影響膠內酶解后磷酸化肽段的富集,反而可以實現(xiàn)快速高效的蛋白酶解,據(jù)此建立了一種快捷、高效的蛋白質酶解方法。首先, 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳,對50 μg復雜蛋白樣品進行分離,分成5個組分; 然后, 選擇高濃度胰蛋白酶酶解30 min; 最后,運用固定鈦離子親和色譜小柱離心法富集磷酸化肽段。經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質譜分析,成功鑒定到約2000個磷酸化位點,而傳統(tǒng)方法則只鑒定到不足1500個位點。實驗表明,在高濃度胰蛋白酶的促進作用下,膠內酶解過程在0.5 h內即可以完成,并且得到比對照組更高的磷酸化位點的鑒定量和更低的酶解漏切率,而傳統(tǒng)方法需要16 h。這也證實了本方法不僅可以加速酶解反應,同時還能提高蛋白酶解效率。

      關鍵詞 高濃度酶; 膠內酶解; 磷酸化蛋白質組學

      1 引 言

      聚丙烯酰胺凝膠電泳是一項高效的蛋白質分離技術,它可以實現(xiàn)包含有成千上萬個蛋白質的復雜蛋白樣品的深度分離[1]。通過與質譜技術的聯(lián)用,可以實現(xiàn)這些蛋白質點的規(guī)?;b定,已經(jīng)成為Bottom-up蛋白質組學研究方法(即“鳥槍法”)的重要組成部分。與多維液相色譜-質譜法相比,聚丙烯酰胺凝膠電泳-質譜法具有獨特的優(yōu)點:首先,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳實現(xiàn)了蛋白混合物按照分子量大小的預分離,大大降低了樣品的復雜度,從而可以獲得高動態(tài)范圍的蛋白混合物的鑒定分析; 其次,它對于鹽離子、緩沖溶液以及表面活性劑的耐受程度較高,而這些物質都不利于后續(xù)質譜檢測[2,3]。但是,它復雜、繁瑣的操作流程和較低的酶解效率制約了其在蛋白質組學研究方面的進一步應用[4]。這主要是因為經(jīng)電泳預分離后的蛋白,在后期的膠內酶解過程中,要經(jīng)過多步的洗滌、縮干以及過夜酶解等操作,直接導致了該方法的通量低; 同時, 酶擴散效率低也是導致膠內酶解效率不高的一個主要原因。因此,很多研究者致力于研究快速高效的膠內酶解方法,以滿足蛋白質組學研究對樣品預處理階段日益增強的要求。

      為了提高膠內酶解效率,Havlis等[5]研究了膠內酶解反應的動力學過程,考察了反應溫度、酶濃度、酶解時間以及蛋白條帶的預酶解對于整個酶解過程的影響。他們通過動力學數(shù)據(jù)優(yōu)化了酶解反應條件,發(fā)現(xiàn)選擇較高的酶解溫度、較高的酶濃度,在不影響酶解效率的前提下,可在30 min內實現(xiàn)快速酶解,這主要得益于他們使用了甲基化處理后的胰蛋白酶,此種酶的自酶解概率低,并且可以耐受比較高的酶解溫度,卻不影響最終的酶解特異性。但是,該方法并沒有得到廣泛應用,可能是因為這種酶價格昂貴,難以推廣使用。在此基礎之上,Dycka等[6]研究了超聲處理和紅外輻射對于膠內酶解的促進作用,證實了這兩種方法都是潛在的可以用來提高膠內酶解效率的策略,可以使原本耗費過夜的酶解過程在幾分鐘內輕松實現(xiàn)。除此之外,微波輔助法也已經(jīng)是一種被廣泛用于加速膠內酶解的方法,但是將它用于復雜蛋白的快速膠內酶解還存在一定的難度[7~9]。Saveliev等[3]則利用質譜兼容的表面活性劑提高膠內酶解效率,蛋白酶解加上肽段提取的總時間不超過1 h,并且,肽段的回收率也高于傳統(tǒng)方法,顯示出了這種表面活性劑的獨特應用,只是這種表面活性劑在酶解過程中會發(fā)生降解,其降解產(chǎn)物對于質譜鑒定的影響仍亟需進一步的考察。

      眾所周知,酶解過程中,使用高濃度的胰蛋白酶,蛋白的酶解速率也就隨之增高[10]。這是一種很直接的用于加速蛋白酶解的方法,但是卻存在嚴重的胰蛋白酶自酶解現(xiàn)象。高強度的胰蛋白酶自酶解峰,會在質譜分析時抑制正常肽段出峰,這也正是蛋白酶解時不宜選用過高酶濃度的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn),高濃度的酶對后續(xù)磷酸化的富集分析幾乎沒有影響。這是因為只有磷酸肽才能被富集出來進行后續(xù)質譜分析,從而避免了胰蛋白酶自酶解現(xiàn)象對于后續(xù)質譜檢測的影響。本研究將該方法應用于磷酸化蛋白質組學的研究。在高濃度胰蛋白酶的促進作用下,膠內酶解反應可在0.5 h內基本完成,而在傳統(tǒng)方法中,這一過程常需要16 h左右。繼而運用填充了固定鈦離子親和色譜(Ti-IMAC)材料的小柱(Tip)進行磷酸肽富集,于50 μg子宮頸癌細胞(HeLa)蛋白樣品中,成功鑒定到了約2000多個磷酸化位點,比傳統(tǒng)方法多鑒定到了約40%的磷酸化位點; 酶解漏切率卻遠低于傳統(tǒng)方法。這說明此方法不僅可以加速酶解反應,同時還能提高膠內酶解效率。不僅如此,本方法在高分子量蛋白和低豐度蛋白的鑒定方面,也都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法,進一步顯示出了本方法相較于傳統(tǒng)方法良好的互補性。

      2 實驗部分

      2.1 儀器與試劑

      LTQ Orbitrap Velos質譜儀(美國Thermo公司),配有納升級電噴霧離子源和六通閥; Accela 600 HPLC液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo公司),配有脫氣機和四元液相泵。

      子宮頸癌細胞(HeLa)來源于中國醫(yī)學科學院血液病研究所; RPMI-1640細胞培養(yǎng)基(美國Gibco Invitrogen公司); 甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、蛋白酶抑制劑(Cocktail)、NaF、正釩酸鈉(Na3VO4)、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(AP)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(IAA)和TPCK 處理的胰蛋白酶(美國Sigma 公司); 乙腈(色譜純)、25%氨水(德國Merck公司); 40%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺(29∶1)、考馬斯亮藍R250(美國Bio-Rad公司); 預染蛋白分子量標準、蛋白上樣緩沖液(美國Thermo公司); GE Loader tips (20 μL, 德國Eppendorf公司); 10% SDS(上海碧云天生物技術研究所); 二次去離子水經(jīng)過Mill-Q水純化系統(tǒng)處理; 其余試劑均為分析純。

      2.2 實驗方法

      HeLa細胞在RPMI 1640培養(yǎng)基內培養(yǎng), 加入了10%新生小牛血清和100 U/mL雙抗,溫度設定為37℃,CO2濃度為5%。當細胞長至對數(shù)生長期后,收集細胞并用冷的PBS緩沖溶液洗滌兩次。采用文獻\[11\]的方法進行蛋白提取。

      將已知濃度的蛋白溶液和電泳上樣緩沖液按照一定比例混合之后,沸水浴5~10 min。將適量蛋白樣品上樣到12%聚丙烯酰胺凝膠中,在80 V電壓下,濃縮20 min,繼而調至120 V,繼續(xù)電泳至蛋白充分分離。將所得膠條用考馬斯亮藍溶液染色,脫色至看到清晰的蛋白條帶。掃描完蛋白條帶之后,將蛋白條帶分成多個組分,手動切割成1 mm× 1 mm的膠條,并轉移至離心管內,加入脫色液(100 mmol/L NH4HCO3-乙腈(1∶1, V/V), 在4℃條件下,振蕩脫色,30 min換一次脫色液,至充分脫去考馬斯亮藍的顏色。加入純乙腈使膠條充分縮干,繼而加入20 mmol/L DTT溶液,37℃振蕩反應2 h; 洗去多余DTT溶液后,加入55 mmol/L IAA溶液,室溫黑暗中振蕩反應1 h。充分洗滌剩余的IAA溶液,用乙腈縮干膠條,實驗組加入300 ng/ 的胰蛋白酶溶液,而對照組則是加入15 ng/ 的胰蛋白酶溶液,放置于4℃,使膠條充分吸收酶溶液至飽和狀態(tài),再稍微補加20~30 μL 100 mmol/L NH4HCO3溶液至液面浸過膠條以上。實驗組在37℃酶解反應0.5 h,而對照組在37℃酶解反應16 h。將所得肽段萃取溶液,在室溫真空干燥,用80%乙腈-6%三氟乙酸溶液復溶,繼而用填有Ti-IMC材料的Tip進行磷酸化肽段的富集。所得磷酸化肽段,室溫真空干燥,用0.1%甲酸溶液復溶,用于質譜上樣。

      具體富集過程同文獻[12,13]一致。將GE Loader tips(20 μL)的尖端塞入少許脫脂棉,充當塞子。取適量Ti-IMAC材料(材料與蛋白的質量比為15∶1),用上樣緩沖液(80% ACN, 6% TFA)重懸,加入槍頭內,離心去掉溶液,待用。蛋白酶解液用上樣緩沖液復溶后,加入槍頭內,以1000 g的轉速離心富集。依次用洗滌緩沖液1(50% ACN, 6% TFA, 200 mmol/L NaCl)和2(30% ACN, 0.1% TFA)分別洗滌一次,保持轉速為1500 g。最后,用100 μL 10%氨水洗脫磷酸肽兩次,合并洗脫液,室溫凍干, -30℃保存待用。

      2.3 質譜方法

      復溶的樣品采用自動進樣系統(tǒng)上樣至質譜儀,自動上樣系統(tǒng)包括一段4 cm的毛細管富集柱(200 μm i.d.)和一段15 cm的毛細管分析柱(75 μm i.d.),將毛細管分析柱在高溫下拉成內徑約為3 μm的尖頭,用氣壓法將兩根柱子都填充C18 AQ填料。液相色譜-質譜系統(tǒng)的流速約為200 nL/min。流動相A為0.1% 甲酸-水溶液; 流動相B 為0.1% 甲酸-乙腈溶液。洗脫梯度設置如下: 0~2 min,0%~2% B; 2~92 min,2%~25% B; 92~97 min,25%~35% B; 97~100 min,35%~80% B; 100~110 min,80% B; 110~120 min,100% A。

      LTQ Velos質譜儀在正離子模式下進行肽段檢測,離子傳輸毛細管的溫度為250℃,噴霧電壓為2.2 kV,歸一化碰撞能量為35.0%。采用數(shù)據(jù)依賴模式(DDA)進行采集,包含一次MS全掃描(m/z 400~2000),分辨率為60000,然后對其中強度最高的20個峰進行二級MS/MS掃描分析,系統(tǒng)的操作和數(shù)據(jù)的采集都使用Xcalibur軟件(v2.1,Thermo公司)完成。

      2.4 數(shù)據(jù)處理

      所收集的*.RAW文件用Thermo Proteome Discoverer Daemon (v1.4)轉換成*.MGF格式,通過Mascot Daemon(Version 2.3)在人源蛋白質數(shù)據(jù)庫(Uniprot human,包含88473個條目)進行檢索。搜庫參數(shù)設置如下:胰蛋白酶酶切,允許最多兩個漏切位點,固定修飾為半胱氨酸碘代酰胺烷基化(+57.0215 Da),可變修飾為甲硫氨酸的氧化(+15.9949 Da),絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的磷酸化(+79.96633 Da)。母離子的質量容忍偏差為10 ppm,碎片離子為0.8 Da。導出肽段時設置Score>25、p<0.01,同時控制假陽性率(FDR)<1%。

      3 結果與討論

      3.1 實驗條件的選擇

      動態(tài)范圍寬和化學計量數(shù)低一直是磷酸化蛋白質組學深入研究的制約因素,這對樣品的預處理過程提出了一定的要求,尤其是微量樣品的磷酸化分析。在之前的工作中,本研究組發(fā)展了一種便捷高效的樣品預處理方法用于磷酸化蛋白質組學分析[14]。該方法利用高濃度胰蛋白酶可以促進蛋白酶解這一原理,實現(xiàn)了短時間內的樣品處理; 同時利用Ti-IMAC Tip離心法富集磷酸化肽,降低樣品的損失,最終實現(xiàn)微量樣品的快速磷酸化分析。Ti-IMAC Tip離心法就是將適量Ti-IMAC材料填充于特制的槍頭內,運用離心力進行磷酸化肽段的富集。該方法簡單高效,同時可以減少樣品的損失,適用于微量樣品的組學分析。本研究將此方法與高分辨的SDS-PAGE技術聯(lián)用,旨在建立高效快速的膠內酶解方法,并用于磷酸化蛋白質組的分析。

      研究表明,選用高濃度胰蛋白酶酶解對于后續(xù)磷酸化肽段的富集幾乎沒有影響,甚至當酶量增大至蛋白量的10倍時,依然可以鑒定到相同數(shù)量的磷酸化位點[14]。因此,可以采用高濃度胰蛋白酶加速膠內酶解反應,并將其應用于磷酸化蛋白質組學研究。首先,基于此前研究的酶解反應條件,驗證此方法的可行性。如圖1A所示,將單一泳道上的蛋白條帶(含120 μg HeLa 蛋白)依據(jù)主蛋白條帶(即顏色最深的條帶)分成6個組分。取相鄰兩個泳道同時進行實驗組和對照組的實驗。實驗組采用文獻[14]優(yōu)化得到的酶解反應條件,即酶濃度為300 ng/μL,酶解時間30 min; 而對照組則采用傳統(tǒng)的酶解方法,所用的酶濃度為15 ng/μL,酶解時間為16 h。待酶解完成后,用Ti-IMAC Tip法富集酶解液中的磷酸化肽段,而后進行LC-MS/MS分析,重復一次。結果如表1所示,在每一個組分里,實驗組都獲得了比對照組更高的磷酸肽的鑒定量,并且所有組分的磷酸肽的富集特異性基本穩(wěn)定在80%以上,證明了Ti-IMAC Tip法的高效性和穩(wěn)定性,也同時驗證了這種快速高效的酶解方法的可行性。

      3.2 微量樣品的磷酸化分析

      將此方法應用于微量樣品的磷酸化分析。如圖1B,將含有50 μg HeLa蛋白的膠條分成5個組分,酶解富集后,進行LC-MS 分析。質譜結果如表2所示,相較于對照組,實驗組的每一個組分在短短30 min內都鑒定到了更多非冗余的磷酸化位點、磷酸化肽段以及磷酸化蛋白。將5個組分的鑒定結果綜合在一起,對照組最終鑒定到1431個磷酸化位點,而實驗組則鑒定到多達1997個磷酸化位點,比對照組多鑒定到約40%的磷酸化位點。同樣,在磷酸化肽段鑒定方面,實驗組比對照組多鑒定到約45%的磷酸化肽段; 在磷酸化蛋白鑒定方面,實驗組則比對照組多鑒定到40%的磷酸化蛋白。3個方面的數(shù)據(jù)都說明,本方法獲得了更好的質譜鑒定結果,并且將原本復雜繁瑣的膠內酶解過程縮短至僅需30 min。

      3.3 磷酸化肽段漏切率的比較

      酶解漏切率的高低是檢驗蛋白酶解是否充分高效的重要指標之一,而且高漏切率會增加蛋白搜庫匹配的錯誤率,從而影響蛋白的可靠鑒定。本研究統(tǒng)計了實驗組和對照組中酶解反應的漏切率(漏切率=含有漏切位點的磷酸肽數(shù)目/所有的磷酸肽數(shù)目)。結果如圖2所示,在5個組分中,對照組的酶解漏切率都明顯高于實驗組。已知在磷酸化蛋白質組學分析中,影響蛋白酶解漏切的主要因素是磷酸化修飾殘基和其它一些酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)離酶切位點(精氨酸、賴氨酸)太近,以至阻礙了胰蛋白酶識別位點的效率[15]。因此,有文獻指出,磷酸化肽段的漏切率高達普通肽段的4倍,而本實驗鑒定到的漏切率與文獻[6,16]報道基本一致。進一步分析可以得知,實驗組的漏切率明顯低于對照組,極有可能是因為高濃度胰蛋白酶的存在減弱了磷酸化修飾殘基和其它酸性氨基酸對蛋白酶切的影響。這也證明了高濃度的胰蛋白酶在加速酶解反應的同時,也可以提高蛋白酶解的效率。

      3.4 相鄰組分間磷酸化蛋白鑒定的覆蓋度

      統(tǒng)計了相鄰組分間磷酸化蛋白鑒定的覆蓋率。如圖3所示,無論是實驗組還是對照組,兩個相鄰組分間所鑒定到的磷酸化蛋白的覆蓋率均約為20%,這充分證明了聚丙烯酰胺凝膠電泳法優(yōu)異的分離蛋白的能力,也是聚丙烯酰胺凝膠電泳法不可被取代的重要原因之一。在實驗組和對照組中,

      分析了不同組分所鑒定到的所有蛋白的平均分子量的分布情況。結果如圖4所示,蛋白平均分子量依次遞減的趨勢是與SDS-PAGE分級的情況完全一致的,這也再次從側面證明了相鄰組分間的覆蓋率是較低的,幾乎不會影響到相鄰組分的蛋白鑒定。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),實驗組鑒定到的蛋白的平均分子量比對照組略高,這表明了實驗組在鑒定高分子量蛋白方面似乎更有優(yōu)勢。這可能是由于大蛋白體積較大、酶切位點較多,因而,與胰蛋白酶接觸的幾率也就較高,在較短的酶解時間內更容易被鑒定到,這也說明了本方法與傳統(tǒng)方法具有一定的互補性。計算了本方法和傳統(tǒng)方法之間的覆蓋率,結果為42.7%。該數(shù)值與文獻\[17\]所報道的不同方法間的覆蓋率值是相接近的, 說明本方法是可靠的,可以對傳統(tǒng)方法進行一定程度的補充。

      3.5 磷酸化蛋白豐度的差異

      對實驗組和對照組中所鑒定到的蛋白豐度的分布情況進行了統(tǒng)計和比較。所有文獻已報道的蛋白豐度值[18]都可以在線查詢獲得(http://pax-db.org/), 將得到的蛋白豐度值取對數(shù),得豐度分布圖。如圖5所示,在低豐度蛋白的鑒定方面,實驗組表現(xiàn)出更高的鑒定效率; 而在高豐度蛋白的鑒定方面,對照組則表現(xiàn)出較高的鑒定效率。正如文獻\[19\]討論的,在整個酶解過程中,最先發(fā)生酶解的是那些與酶結合力強,也就是較易斷裂的位點,這是通過胰蛋白酶識別位點附近的序列實現(xiàn)的。當選擇較短的酶解時間時,無論是高豐度的蛋白還是低豐度的蛋白,都是序列中最先被切割而被釋放出來的肽段,與此同時,因為采用了高濃度的胰蛋白酶,使得低豐度的蛋白較快酶解完全,這樣,在短時間內,低豐度蛋白產(chǎn)生的肽段就不易被高豐度蛋白產(chǎn)生的肽段所抑制; 而在低濃度的胰蛋白酶條件下,隨著酶解時間的逐漸增長,所有蛋白的所有肽段都得到了釋放,這樣高豐度蛋白就會大大抑制低豐度蛋白,從而使低豐度蛋白的鑒定變得比較困難。眾所周知,低豐度蛋白的鑒定一直是蛋白質組學研究的難點,而高濃度胰蛋白酶輔助酶解法在這方面體現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢,因此,基于高濃度胰蛋白酶的快速酶解法具有更廣闊的應用前景。

      4 結 論

      本研究建立了一種快速高效的膠內酶解方法,并將其應用于微量樣品的磷酸化分析。通過采用高濃度的胰蛋白酶進行膠內酶解,在30 min內完成酶解反應,將其用于50 μg HeLa 蛋白的磷酸化分析,獲得了遠優(yōu)于對照組的鑒定結果,并且酶解漏切率卻低于傳統(tǒng)方法。這證明了本方法的高效性,不僅可以促進膠內酶解反應,同時可以提高膠內酶解的效率。除此之外,本方法在鑒定高分子量、低豐度蛋白方面,都顯示出了優(yōu)于傳統(tǒng)方法的性能,本方法可以作為傳統(tǒng)方法的補充,會獲得更廣闊的應用空間。

      References

      1 Grg A, Weiss W, Dunn M J. Proteomics, 2004, 4(12): 3665-3685

      2 Shevchenko A, Tomas H, Havlis J, Olsen J V, Mann M. Nat. Protoc., 2007, 1(6): 2856-2860

      3 Saveliev S V, Woodroofe C C, Sabat G, Adams C M, Klaubert D, Wood K, Urh M. Anal. Chem., 2012, 85(2): 907-914

      4 Rabilloud T, Vaezzadeh A R, Potier N, Lelong C, Leize-Wagner E, Chevallet M. Mass Spectrom. Rev., 2009, 28(5): 816-843

      5 Havli J, Thomas H, ebela M, Shevchenko A. Anal. Chem., 2003, 75(6): 1300-1306

      6 Dycka F, Bobal P, Mazanec K, Bobalova J. Electrophoresis, 2012, 33(2): 288-295

      7 Pramanik B N, Mirza U A, Ing Y H, Liu Y H, Bartner P L, Weber P C, Bose A K. Protein Sci., 2002, 11(11): 2676-2687

      8 Juan H F, Chang S C, Huang H C, Chen S T. Proteomics, 2005, 5(4): 840-842

      9 Sun W, Gao S, Wang L, Chen Y, Wu S, Wang X, Zheng D, Gao Y. Mol. Cell. Proteomics, 2006, 5(4): 769-776

      10 Hustoft H K, Reubsaet L, Greibrokk T, Lundanes E, Malerod H. J. Pharm. Biomed. Anal., 2011, 56(5): 1069-1078

      11 Bian Y, Ye M, Song C, Cheng K, Wang C, Wei X, Zhu J, Chen R, Wang F, Zou H. J. Proteome Res., 2012, 11(5): 2828-2837

      12 Zhu J, Wang F, Chen R, Cheng K, Xu B, Guo Z, Liang X, Ye M, Zou H. Anal. Chem., 2012, 84(11): 5146-5153

      13 Zhou H, Ye M, Dong J, Corradini E, Cristobal A, Heck A J R, Zou H, Mohammed S. Nat. Protoc., 2013, 8(3): 461-480

      14 Liu F, Ye M, Pan Y, Zhang Y, Bian Y, Sun Z, Zhu J, Cheng K, Zou H. Anal. Chem., 2014, 86(14): 6786-6791

      15 Molina H, Horn D M, Tang N, Mathivanan S, Pandey A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2007, 104(7): 2199-2204

      16 Lin Y, Li Y, Liu Y, Han W J, He Q Z, Li J L, Chen P, Wang X C, Liang S P. Electrophoresis, 2009, 30(20): 3626-3635

      17 Bodenmiller B, Mueller L N, Mueller M, Domon B, Aebersold R. Nat. Methods, 2007, 4(3): 231-237

      18 Wang M, Weiss M, Simonovic M, Haertinger G, Schrimpf S P, Hengartner M O, von Mering C. Mol. Cell. Proteomics, 2012, 11(8): 492-500

      19 Ye M L, Pan Y B, Cheng K, Zou H F. Nat. Methods, 2014, 11(3): 220-222

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