王開萍，李紅衛(wèi)，吳　娛，唐正江，湯　飛，劉國(guó)慶（合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009）

米曲霉As-W6脂肪酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

王開萍，李紅衛(wèi)，吳娛，唐正江，湯飛，劉國(guó)慶*
（合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009）

米曲霉As-W6的脂肪酶發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、透析、DEAE-52纖維素離子交換層析和Sephadex G-75葡聚糖凝膠過濾層析純化后得到電泳純的脂肪酶，純化倍數(shù)為86.7倍，回收率為23.2%，相對(duì)分子質(zhì)量為40.8 ku，酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，該脂肪酶最適反應(yīng)溫度和最適pH分別為40℃和7，在40℃以下和pH6～8之間有較好的穩(wěn)定性；Ca2+、Mg2+和丙酮能夠明顯促進(jìn)提高脂肪酶的活性，而Cu2+、Fe2+、Mn2+和SDS對(duì)其有顯著抑制作用；當(dāng)大豆油作為底物時(shí)該脂肪酶的酶活力最高，表明其對(duì)大豆油具有顯著的特異性。

米曲霉，脂肪酶，分離純化，酶學(xué)性質(zhì)

脂肪酶（acylglycerol hydrolases，EC 3.1.1.3）是一類能催化水解脂肪酸和油脂為甘油和游離脂肪酸的生物催化劑，廣泛存于動(dòng)物、植物各種組織和微生物中［1］。脂肪酶因具有巨大的生理意義和工業(yè)應(yīng)用范圍而受到廣泛關(guān)注，近年來，脂肪酶已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品、洗滌劑、制革、有機(jī)合成等行業(yè)［2］。生物來源的脂肪酶具有比動(dòng)植物更廣的作用pH、作用溫度范圍，以及底物專一性，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源［3］。最常用的脂肪酶生產(chǎn)菌有曲霉、根霉、毛霉、青霉菌屬等［4-6］。米曲霉是脂肪酶生產(chǎn)者之一，且米曲霉脂肪酶具有良好的生物安全性，因而被廣泛應(yīng)用在脂肪酶生產(chǎn)行業(yè)或其他相關(guān)行業(yè)［7-8］。Aspergillus oryzae As-W6是本實(shí)驗(yàn)室篩選保存的一株產(chǎn)脂肪酶菌，產(chǎn)酶量高，培養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，可進(jìn)行大批量生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)米曲霉產(chǎn)脂肪酶的研究相對(duì)較少，文獻(xiàn)報(bào)道的米曲霉所產(chǎn)脂肪酶的溫度、pH作用范圍不大，穩(wěn)定性不高［9-10］。本文對(duì)該米曲霉脂肪酶的分離純化進(jìn)行研究，提供了一種有關(guān)脂肪酶分離純化的方法，該脂肪酶具有良好的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定范圍，其具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

Aspergillus oryzae As-W6本實(shí)驗(yàn)室選育保存菌種；DEAE纖維素、Sephadex G-75葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺Marker Sigma公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司；硫酸銨、甲醇、乙醇、丙醇、聚乙烯醇、橄欖油國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，分析純。

SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái)蘇州凈化有限公司；SPX-150B型生化恒溫培養(yǎng)箱上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；752型紫外可見分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司；SYQ-DSX-280B型高壓滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；THZ-92B型搖床上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市杰瑞爾電氣有限公司；TDL-50B型臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；SBE-6003型電泳儀上海博彩生物技術(shù)有限公司；GmbH紫外凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Biostep公司。

1.2脂肪酶的發(fā)酵生產(chǎn)與制備

脂肪酶的發(fā)酵生產(chǎn)參照陳林林等［11］的報(bào)道。菌種在PDA培養(yǎng)基上活化后，用無菌水制成孢子懸浮液，每毫升含105～106個(gè)孢子。按2%的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基（酵母浸膏1%，葡萄糖1%，（NH4）2SO40.1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，KCl 0.05%，NaNO30.05%，橄欖油乳化液4%）中，在32℃，180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)72 h。

1.3脂肪酶酶活的測(cè)定

脂肪酶酶活的測(cè)定采用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解滴定法［12］。酶活力單位定義：在40℃，pH7.0條件下水解橄欖油乳化液，每分鐘產(chǎn)生1 μmol游離脂肪酸所需要的酶量，即為1個(gè)脂肪酶活力單位（1U）。

1.4蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Bradford法［13］測(cè)定，用牛血清蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.5脂肪酶的分離純化

1.5.1硫酸銨沉淀參考舒正玉等［14］的方法加以改進(jìn)，將發(fā)酵液用雙層紗布過濾后，4℃，12000 r/min離心20 min得到發(fā)酵上清液，用0.45 mm的微孔濾膜過濾上清液除去橄欖油。收集濾液，將其作為酶液的粗提取，酶活被定義為100%，用來計(jì)算純化過程中的回收率，回收率=每步總活力/原液總活力，比活力=總活力/總蛋白。先將粗酶液中加入硫酸銨細(xì)粉末至30%飽和度，去除雜蛋白沉淀，再向上清液中加入硫酸銨細(xì)粉末至80%飽和度，離心收集沉淀，透析脫鹽后冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

就在族長(zhǎng)即將暴怒時(shí)，一個(gè)聲音從后方天葬院中傳了出來：“我以天葬師之名，接受你的訴求，為了云浮的未來，敬祈天神！”

1.5.2離子交換層析將上述保存的酶溶解于0.05 mol/L，pH=7的Tris-HCl緩沖液中，然后上樣于裝有DEAE-52纖維素的層析柱中（1.8 cm×100 cm），以0～1.0 mol/L NaCl線性梯度洗脫，洗脫液流速為1.0 mL/min。在280 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定每管洗脫液的酶活力，收集合并有活性部分，真空冷凍干燥。

1.5.3凝膠過濾層析將上一步冷凍干燥的酶粉溶解于0.05 mol/L、pH=7的Tris-HCl緩沖液中，然后上樣于裝有Sephadex G-75葡聚糖凝膠的層析柱中（2.6 cm× 10 cm），以0～1.0 mol/L NaCl線性梯度洗脫，洗脫液流速為1.0 mL/min。按上述方法測(cè)定每管洗脫液的酶活性，收集合并有活性部分，真空冷凍干燥。

1.5.4脂肪酶分子量的測(cè)定采用聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳法（SDS-PAGE）測(cè)定純化酶的分子量，參照1970年Laemmli的方法［15］，根據(jù)膠濃度與最佳分離分子量范圍的關(guān)系，選取分離膠的濃度為12%，濃縮膠的濃度為5%，用考馬斯亮藍(lán)G-250染色。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)Marker的分子質(zhì)量為19～117 ku。

1.6酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1不同溫度對(duì)脂肪酶活性及其穩(wěn)定性的影響將反應(yīng)體系分別置于在20、30、40、50、60℃的水浴中，分別測(cè)定脂肪酶的酶活力，確定最適反應(yīng)溫度。取同樣濃度的脂肪酶分別置于20、25、30、35、40、45、50、55、60℃的水浴中保溫4 h，每隔1 h取樣測(cè)定殘留酶活，用未經(jīng)處理的酶液的酶活為100%。

1.6.2不同pH對(duì)脂肪酶活性及其穩(wěn)定性的影響將酶液分別與等量的pH4～10的系列緩沖液混合，測(cè)定脂肪酶的酶活。系列緩沖液為：50 mmol/L醋酸鹽緩沖液（pH4～5），50 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH5～6），50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH6～8），50 mmol/L Tris緩沖液（pH8～9），50 mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9～10）。脂肪酶在pH4～10條件下分別在40℃保溫1 h后，測(cè)定脂肪酶殘留酶活，以最適條件下的酶活為100%。

1.6.3不同金屬離子對(duì)脂肪酶活性的影響在測(cè)酶活反應(yīng)體系中，分別加入終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L的Fe2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Mn2金屬鹽離子，陰離子均為氯離子，30℃下放置30 min，分別測(cè)定脂肪酶的殘留酶活，以不加金屬離子的酶液作對(duì)照（100%）。

1.6.4不同有機(jī)溶劑對(duì)脂肪酶活性的影響將甲醇、乙醇、丙酮、EDTA、SDS、Tween-80 6種有機(jī)溶劑分別按1%、5%的量加入酶反應(yīng)體系，然后反應(yīng)30 min，分別測(cè)定脂肪酶的殘留酶活，以未加入有機(jī)溶劑的酶液作為對(duì)照組（100%）。

1.6.5脂肪酶對(duì)不同底物的水解特異性參照Rigo等［16］的方法測(cè)定脂肪酶對(duì)不同底物的水解特異性，將橄欖油、大豆油、棕櫚油、丁酸甲酯、辛酸甲酯、月桂酸甲酯、棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯作為脂肪酶水解反應(yīng)的底物，分別測(cè)定脂肪酶的酶活，以橄欖油為底物測(cè)得的酶活為100%。

2　結(jié)果與分析

2.1脂肪酶的純化

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，y=5.93x-0.01，R2=0.9978，蛋白質(zhì)濃度和吸光度呈良好的線性相關(guān)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白的含量。經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-52纖維素陰離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過濾層析純化后，脂肪酶蛋白純化了86.7倍，回收率為23.2%，比活力為528.7。其中Sephadex G-75凝膠過濾層析效果最佳，這一步純化了6.9倍，純化結(jié)果見表1。采用聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳法（SDS-PAGE）測(cè)定純化酶的分子量，結(jié)果見圖2，圖中第1列為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)Marker，第2列為粗酶液；第3列為純酶。從圖2中可以看出，第2列的粗酶液電泳所得的條帶不止一條，除目標(biāo)酶外還有三條顏色和清晰度均比較暗的條帶，而純化后的酶的條帶如第3列所示，呈現(xiàn)明亮清晰的單一條帶，目標(biāo)蛋白位于34～49 ku之間，這說明目標(biāo)脂肪酶得到了較好的純化，回收率較高。通過Quantity One軟件對(duì)凝膠圖像分析計(jì)算，得出目標(biāo)脂肪酶蛋白的分子量約為40.8 ku。

表1　米曲霉脂肪酶的純化Table 1　Purification of lipase from Aspergillus oryzae As-W.6

圖1　牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of BSA

圖2　米曲霉脂肪酶的SDS-PAGE凝膠電泳分析圖Fig.2　SDS-PAGE analysis of lipase

2.2米曲霉脂肪酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

在20～60℃下分別測(cè)定脂肪酶的酶活力，結(jié)果見圖3，酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，在溫度不高于40℃時(shí)，酶活力隨溫度的升高而增加，當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，酶活力會(huì)隨著溫度的升高而降低，當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，酶活力僅為最適反應(yīng)溫度酶活力的8.6%。從圖4中可以看出，該酶在35℃下保溫4 h后還有83.2%的殘余酶活，所以該酶在25～35℃具有較好的穩(wěn)定性。

圖3　溫度對(duì)脂肪酶酶活力的影響Fig.3　Effect of temperature on enzyme activity

圖4　脂肪酶的溫度穩(wěn)定性Fig.4　Heat stability of lipase

2.3脂肪酶的最適pH和pH穩(wěn)定性

由圖5可知，脂肪酶作用的最適pH為7，且在pH在6～7.5范圍內(nèi)，酶活力均在80%以上。將脂肪酶酶液加入上述不同pH的緩沖液中，在40℃下保溫1 h后測(cè)定脂肪酶酶活，結(jié)果見圖5。觀察酶的pH穩(wěn)定性曲線可知，在1 h的保溫時(shí)間內(nèi)，在pH＜7時(shí)，pH的穩(wěn)定性會(huì)隨著pH的增大而增強(qiáng)；在pH＞7時(shí)，pH的穩(wěn)定性會(huì)隨著pH的增大而減弱。在pH=4時(shí)保溫1 h后，酶活力為保溫前的酶活力的32.5%，但是在pH=10時(shí)保溫1 h后，酶活力僅為保溫前的酶活力的28.7%。由以上可知，該脂肪酶的最適反應(yīng)pH為7，在pH 6～8時(shí)有較高的活力且在保溫1 h后能保存70%以上的酶活。

圖5　pH對(duì)脂肪酶的酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.5　Effect of pH on enzyme activity and stability

2.4金屬離子對(duì)脂肪酶活性的影響

如圖6所示，在常見的幾種二價(jià)金屬離子中，濃度為1 mmol/L的Ca2+、Mg2+和Zn2+均能夠激活酶的活性，金屬離子濃度增加為5 mmol/L時(shí)，Ca2+、Mg2+對(duì)酶活性的激活性降低，而Zn2+則抑制酶的活性，Cu2+、Fe2+、Mn2+對(duì)酶活性的抑制作用增強(qiáng)，這可能是由于金屬離子濃度升高對(duì)酶活性起抑制作用。不同金屬離子對(duì)酶活力的影響不同，其中Cu2+、Fe2+對(duì)酶活力的抑制作用極強(qiáng)，Mn2+對(duì)酶活力也有抑制作用。此外，酶活力會(huì)隨著幾種金屬離子濃度的增加均有所降低。因此，可以選擇適當(dāng)濃度的Ca2+、Mg2+作為該酶的活化劑，提高該脂肪酶的活力。

圖6　不同金屬離子對(duì)脂肪酶活性的影響Fig.6　Effect of various metal ions on enzyme activity

2.5有機(jī)溶劑對(duì)脂肪酶活性的影響

如圖7所示，在常見的幾種有機(jī)溶劑中，甲醇（1%）、丙醇（1%）和Tween-80（1%）能夠進(jìn)一步激活酶的活性，而乙醇、SDS和EDTA則抑制酶的活性。不同濃度的有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響不同，但當(dāng)濃度為5%時(shí)，這6種有機(jī)溶劑均對(duì)酶的活性起抑制作用。和金屬離子相比，有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響較小。由此可知，該脂肪酶是一種金屬酶，金屬離子對(duì)酶活的影響非常明顯。

圖7　不同有機(jī)溶劑對(duì)酶活的影響Fig.7　Effect of various organic solvents on enzyme activity

2.6脂肪酶對(duì)不同底物的水解特異性

從圖8中可以看出，該脂肪酶對(duì)植物油的水解酶活力明顯高于幾種甲酯酸，其中大豆油表現(xiàn)最為明顯的特異性。在5種甲酯酸中，該脂肪酶對(duì)C12、C16、C18顯現(xiàn)出較高的酶活力，其中在C12時(shí)達(dá)到最高酶活力，這表明該脂肪酶對(duì)于長(zhǎng)鏈甲酯酸表現(xiàn)出較好的水解酶活力，這與Rigo報(bào)道的從青霉菌（Penicillium crustosum）中純化得到的脂肪酶的性質(zhì)相似［16］。

圖8　脂肪酶水解不同底物的特異性Fig.8　Substrate specificity of enzyme

3　結(jié)論

Aspergillus oryzae As-W6的脂肪酶發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、透析、DEAE-52纖維素離子交換層析和Sephadex G-75葡聚糖凝膠過濾層析純化后得到電泳純的脂肪酶，SDS-PAGE電泳結(jié)果分析計(jì)算出其相對(duì)分子質(zhì)量為40.8 ku，該脂肪酶的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH分別為40℃和7，在40℃以下和pH6～8之間具有較好的穩(wěn)定性。該脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，Ca2+、Mg2+和丙酮能夠明顯促進(jìn)提高脂肪酶的活性，其中Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%，而Cu2+、Fe2+、Mn2+和SDS對(duì)其具有明顯的抑制作用；此外該脂肪酶對(duì)大豆油表現(xiàn)出顯著的特異性。

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Study on purification and characterization of a lipase from Aspergillus oryzae As-W6

WANG Kai-ping，LI Hong-wei，WU Yu，TANG Zheng-jiang，TANG Fei，LIU Guo-qing*
（College of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

A lipase from Aspergillus oryzae As-W6 was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation，dialysis，DEAE-52 cellulose column anion exchange chromatography and Sephadex G-75 gel filtration chromatography.The purification protocol resulted in a 86.7-fold purification with a yield of 23.2%，the relative molecular weight of the purified lipase was 40.8 ku.The optimum temperature and pH of the purified lipase was 40℃and 7，respectively.The lipase was stable over ranges of pH（6～8）and under the temperature 40℃. The lipase activity was enhanced by Ca2+，Mg2+and Acetone，while inhibited by Cu2+，F(xiàn)e2+，Mn2+and SDS.It achieved maximum values when soybean oil used as substrate，which indicated that the lipase showed a significant specificity toward soybean oil.

Aspergillus oryzae；lipase；purification；properties

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0229-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.037

2014－11－14

王開萍（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：paigewang0919@163.com。

劉國(guó)慶（1963-），男，博士，教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究，E-mail：liugq_168@163.com。

安徽省皖江禽產(chǎn)業(yè)研究院基金項(xiàng)目（1401c063015）。