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      供體年齡影響融合生長內(nèi)皮祖細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換及增殖遷移的作用*

      2015-11-08 02:28:14朱光旭阮光萍宋明寶楊建勇康華莉潘興華
      中國病理生理雜志 2015年5期
      關(guān)鍵詞:共培養(yǎng)老齡表型

      朱光旭, 周 芳, 阮光萍, 宋明寶, 楊建勇, 黃 嵐, 康華莉, 潘興華

      動脈粥樣硬化等損傷性血管疾病病理變化主要表現(xiàn)為內(nèi)皮再生延遲以及血管傷處平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells,SMCs)過度增生,導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成。大量研究證實(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)參與血管損傷修復(fù)[1-2],可以有效抑制新生內(nèi)膜增生[2-4]。細(xì)胞間相互作用是細(xì)胞生命活動重要調(diào)節(jié)方式之一。EPCs歸巢到血管損傷部位后,細(xì)胞間的影響主要來自血管損傷邊緣的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)、再生內(nèi)皮或 SMCs,因此推測EPCs與SMCs間相互作用可能在EPCs修復(fù)損傷血管內(nèi)膜過程中起重要調(diào)節(jié)作用。我們前期研究表明,EPCs生物學(xué)活性具有年齡相關(guān)性特點(diǎn),年輕大鼠來源EPCs較老齡大鼠來源者具有更好的增殖、遷移和分化能力[5-6]。本研究通過建立細(xì)胞共培養(yǎng)體系,觀察老齡和年輕個體來源EPCs對SMCs表型和增殖遷移活性的影響,旨在揭示不同年齡個體來源EPCs移植修復(fù)損傷血管過程中對SMCs可能的調(diào)節(jié)作用。

      材料和方法

      1 主要材料

      1~2月齡、19~26月齡的SD大鼠,雌雄不限,無既往病史,環(huán)境濕度、溫度適中,飲食良好,由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。所有動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)第三軍醫(yī)大學(xué)及成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。DMEM/F12干粉培養(yǎng)基(HyClone);內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(endothelial cell growth supplements,ECGs)購于BD;優(yōu)質(zhì)胎牛血清(PAA);DiI標(biāo)記乙?;兔芏戎鞍?DiI-labeled acetylated low-density lipoprotein,DiI-Ac-LDL)購于 Molecular Probe;FITC標(biāo)記荊豆凝集素I(FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin I,F(xiàn)ITC-UEA-I)購于 Vector;Ficoll液(Amersham);大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)購于 Sigma;小鼠抗大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(Flk-1/VEGFR2/KDR)、兔抗大鼠 CD133(BioSource);山羊抗大鼠CD34(Novus);山羊抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、抗大鼠steopontin抗體(Santa Cruz);小鼠抗大鼠 α-SM-actin抗體 (Sigma);[3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷([3H]-TdR)(上海原子核研究所);Transwell培養(yǎng)板(Corning);倒置熒光相差顯微鏡 (Leica);液體閃爍計(jì)數(shù)器(Beckmen)。

      2 方法

      2.1 EPCs的培養(yǎng)及鑒定 脫臼處死SD大鼠,無菌取出股骨和脛骨,PBS沖洗骨髓,F(xiàn)icoll液密度梯度離心 (2 000 r/min,30 min)分離單個核細(xì)胞(mononuclear cells,MNCs),PBS洗滌后,差速貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)[6]。2次貼壁細(xì)胞培養(yǎng)14 d后,DiI-Ac-LDL(10 mg/L)及FITC-UEA-I(10 mg/L)避光孵育,置熒光顯微鏡下觀察。在貼壁細(xì)胞長至約50%融合時收集培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行流式分析,步驟如下:收集細(xì)胞加入2 mL圓底離心管中,PBS洗3次,每次1 min,4℃、1 500 r/min離心5 min,棄上清;用 PBA(含1%牛血清白蛋白及0.1%疊氮鈉)稀釋 I抗,與細(xì)胞混勻,4℃或置冰上孵育1.5 h,離心棄上清;冷PBS 1 mL離心洗滌1次,以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體;加入PBA稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體、PE標(biāo)記驢抗山羊IgG或TRITC標(biāo)記雞抗兔IgG II抗(1∶200)200 μL,吹打混勻,4 ℃或置冰上避光孵育45 min,再用冷PBS 1 mL離心洗滌2次,每次1 min;將細(xì)胞重新懸浮于500 μL PBS中,避光混勻,以同型抗體作為對照置流式管上機(jī)檢測。

      2.2 SMCs培養(yǎng)及鑒定 參照文獻(xiàn)采用組織塊法培養(yǎng)SMCs[7],具體操作過程如下:頸椎脫臼處死大鼠,無菌取大鼠胸腹主動脈,仔細(xì)清除血管外膜及脂肪組織,將血管縱向剖開,用0.01 mol/L PBS漂洗干凈,用眼科鑷刮去血管內(nèi)膜,放入50 mL培養(yǎng)瓶中,在瓶口用眼科剪剪成約1.5 mm ×1.5 mm×1.5 mm大小的組織塊,用吸管將組織塊隨機(jī)鋪于瓶底,于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,將貼有貼塊的培養(yǎng)瓶反轉(zhuǎn)放置使貼塊位于頂側(cè),培養(yǎng)4 h后,加入含20%FBS和雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基,恢復(fù)正常放置繼續(xù)培養(yǎng),每3天換液1次,培養(yǎng)細(xì)胞用α-SM-actin進(jìn)行平滑肌表型鑒定。

      2.3 貼壁細(xì)胞數(shù)目與增殖能力檢測 細(xì)胞首次貼壁培養(yǎng)24 h,棄早期貼壁細(xì)胞,離心收集懸浮細(xì)胞,以15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(含內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑100 mg/L,肝素100 mg/L,青、鏈霉素各1×105U/L)、同等體積培養(yǎng)基以及相同細(xì)胞數(shù)接種于纖維連接蛋白包被24孔板,4 d后棄懸浮細(xì)胞,顯微鏡(×400)下計(jì)數(shù)每個視野下貼壁細(xì)胞數(shù)。首次貼壁后收集懸浮細(xì)胞,離心棄上清,以新鮮培養(yǎng)基分別配成濃度梯度細(xì)胞懸液,接種于纖維連接蛋白包被96孔板,4 d后棄懸浮細(xì)胞,鏡下觀察每孔貼壁細(xì)胞密度,在老年和年輕組分別選擇貼壁細(xì)胞密度大致相等的6孔,加入新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),待生長速度最快的孔內(nèi)EPCs鋪滿孔底約90%后,用MTT法檢測細(xì)胞增殖,每孔加入 MTT(5 g/L)20 μL,37 °C 繼續(xù)孵育4 h,棄上清,各孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO),室溫振蕩 10 min,HT-7000 Plus多孔讀數(shù)儀492 nm讀取吸光度值,以培養(yǎng)液孔作為空白調(diào)零。

      2.4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為 (1)P3組:第3代(P3)SMCs;(2)P4組:將 P3 SMCs以低濃度(2×106cells/L,3 mL/well接種)傳代(P4)培養(yǎng)于6孔板內(nèi),但是上室不接種 EPCs,僅加入等量培養(yǎng)基;(3)P4YE組:上室為融合生長的年輕(young,Y)大鼠來源EPCs,下室為P4 SMCs;(4)P4AE組:上室為融合生長的老齡(aged,A)大鼠來源 EPCs,下室為 P4 SMCs。

      2.5 細(xì)胞共培養(yǎng)體系建立 將骨髓單個核細(xì)胞直接接種于Transwell insert膜(膜孔徑0.4 μm)上,按照我們前期方法進(jìn)行EPCs培養(yǎng)[6],EPCs生長至融合后換無血清培養(yǎng)基,取P3 SMCs,將其以2×106cells/L,3 mL/well接種于6孔板內(nèi),細(xì)胞貼壁后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后將Transwell insert插入種有SMCs的6孔板中,使下室為SMCs,上室為EPCs,換含5%FBS的DMEM/F12(含內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑100 mg/L,肝素100 mg/L,青、鏈霉素各1×105U/L)進(jìn)行培養(yǎng),兩室培養(yǎng)基通過Transwell insert膜交通,從而建立Transwell共培養(yǎng)體系,每3 d換液1次,共培養(yǎng)4 d后進(jìn)行表型標(biāo)志蛋白檢測。

      2.6 Western blotting檢測 α-SM-actin及 osteopontin的表達(dá) 用4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3次,加入預(yù)制的含PMSF的裂解液,冰上裂解30 min,裂解后,將細(xì)胞碎片和裂解液移至離心管。4℃、16 000 r/min離心20 min,收集上清,取其中少量測蛋白濃度(BCA法)。取等量預(yù)處理的蛋白樣品上樣,恒壓81 V進(jìn)行SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉-PBST室溫封閉 1 h后,加入抗大鼠 α-SM-actin抗體(1∶800)、GAPDH 或 osteopontin(1∶600),4 ℃孵育過夜,再與HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG、抗鼠IgG 37℃孵育1 h,化學(xué)發(fā)光顯色后用凝膠成像系統(tǒng)掃描,半定量分析顯影帶,目的蛋白量以GAPDH相對量表示。

      2.7 [3H]-TdR摻入法檢測SMCs增殖 將 P4 SMCs以3×107cells/L、3 mL/well接種于6孔板內(nèi),細(xì)胞貼壁后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,然后將種有EPCs的Transwell insert插入6孔板中,共培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)[8],終止培養(yǎng)前于共培養(yǎng)體系(膜孔徑0.4 μm)中加入[3H]-TdR,使其終濃度為3.7×104kBq/L,繼續(xù)共同培養(yǎng)24 h后用多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞于玻璃纖維濾膜上,用10% 三氯醋酸處理、洗凈,濾膜經(jīng)紅外線烤箱烘烤后置入閃爍瓶,加脂溶性閃爍液,在Beckmen β液體閃爍記數(shù)器上測定,結(jié)果以每分鐘計(jì)數(shù)(counts per mimute,CPM)/well表示,摻入量反映SMCs DNA合成速率。2.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[9],將 SMCs接種到6孔板內(nèi),以含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)待培養(yǎng)SMCs達(dá)到完全融合生長后,用200 μL移液管經(jīng)過板孔中心、比著直尺垂直于板底無菌低速劃痕,用PBS洗細(xì)胞3次,去除劃下的細(xì)胞,插入培養(yǎng)有融合生長狀態(tài) EPCs的 Transwell insert膜,使上室為EPCs,下室為劃痕 SMCs,換含20%FBS的 DMEM/F12(含內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑100 mg/L,肝素100 mg/L,青、鏈霉素各 1 ×105U/L)進(jìn)行培養(yǎng),于 0、6、12、24 h觀察拍照,使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics)進(jìn)行圖像分析。

      3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,以SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      結(jié) 果

      1 培養(yǎng)細(xì)胞的生長特征及鑒定

      1.1 EPCs的培養(yǎng)及鑒定 2次貼壁培養(yǎng)的骨髓EPCs大多呈梭形或卵圓形,在貼壁細(xì)胞數(shù)量上,2次貼壁培養(yǎng)4 d,年輕組來源的骨髓MNCs貼壁細(xì)胞數(shù)量顯著高于老齡組;同等培養(yǎng)條件下年輕個體來源細(xì)胞的增殖活性也顯著高于老年組(P<0.05)。細(xì)胞貼壁后第3天可見明顯索狀生長結(jié)構(gòu);EPCs培養(yǎng)到第14天,老年和年輕組細(xì)胞均逐漸趨于呈融合生長狀態(tài);培養(yǎng)12 d后,年輕和老齡組DiI-Ac-LDL及FITC-UEA-I雙染,隨機(jī)挑選6個視野計(jì)數(shù)雙染陽性細(xì)胞百分率,分別為(92.70±3.45)%與(81.40±7.82)%,表明培養(yǎng)骨髓MNCs具有成熟內(nèi)皮細(xì)胞特征。流式細(xì)胞分析表明培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)CD34、CD133以及Flk-1,年輕組表達(dá)顯著高于老齡組(P<0.01),見圖1。

      Figure 1.Characteristics of bone marrow derived endothelial progenitor cells(EPCs).A:secondary attached cells,the arrow shows the net-work of EPCs;B:EPCs cultured after 14 d AC:DiI-Ac-LDL positive cells;D:FITC-UEA-I positive cells;E:cell number of secondary attached cells;F:histogram analysis of EPCs proliferation;G:FACS analysis of CD34,CD133 and VEGFR2 expression in cultured MNCs after 14 d of culture.Mean±SD.n=4.**P <0.01 vs aged group.圖1 培養(yǎng)骨髓EPCs的生長特征

      1.2 SMCs培養(yǎng)及鑒定 培養(yǎng)5 d左右可見長梭型細(xì)胞自組織塊邊緣長出(圖2A),14 d左右可見培養(yǎng)細(xì)胞呈“谷峰”樣生長(圖2B),取傳代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行α-SM-actin染色呈陽性,對照為陰性,證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為SMCs(圖2C)。

      Figure 2.SMCs culture and identification.A:5 d later,several cells were found around the cultured tissue blocks;B:after 14 d cultured,the cell showed a valley like growth state;C:immunostaining suggested that the cultured cells were expressed α-SM-actin.圖2 培養(yǎng)SMCs的生長特征

      2 共培養(yǎng) EPCs及 SMCs后 SMCs α-SM-actin及osteopontin的表達(dá)

      α-SM-actin是收縮型 SMCs主要標(biāo)志之一[10]。與P3組相比,傳代培養(yǎng)(P4)可使SMCs的α-SM-actin表達(dá)減少,但是與P4YE SMCs的α-SM-actin表達(dá)無顯著差別,表明年輕大鼠來源的EPCs可以延遲SMCs表型轉(zhuǎn)換。與P4YE組比較,共培養(yǎng)老年個體來源EPCs延遲效應(yīng)顯著減弱,但是該組SMCs的α-SM-actin表達(dá)與P3組比較仍顯著高于 P4組,見圖3。

      Figure 3.The effect of co-culture EPCs and donor age on theprotein expression of α-SM-actin in the SMCs.Mean±SD.n=4.**P <0.01 vs P3 group;#P <0.05,##P<0.01 vs P4 group;▽P<0.05 vs P4YE group.圖3 共培養(yǎng)EPCs與SMCs后SMCs α-SM-actin蛋白的表達(dá)

      Osteopontin是合成型 SMCs的主要標(biāo)志[9]。與P3組相比,SMCs傳代培養(yǎng)可使SMCs(P4)內(nèi)的osteopontin增強(qiáng)(P<0.01);而共培養(yǎng)年輕大鼠來源EPCs組(P4YE)SMCs的osteopontin表達(dá)與P3組比較未見有顯著差別;與P4YE組比較,老齡個體來源的EPCs抑制osteopontin的表達(dá)能力顯著減弱,但是其表達(dá)仍顯著低于P4組(P<0.05),見圖4。

      Figure 4.The effect of co-culture EPCs and donor age on theprotein expression of osteopontin in the SMCs.Mean±SD.n=4.**P <0.01 vs P3 group;#P <0.05,#P<0.01 vs P4 group;▽P<0.05 vs P4YE group.圖4 共培養(yǎng)EPCs與SMCs后SMCs osteopontin蛋白的表達(dá)

      3 共培養(yǎng)EPCs對SMCs的增殖的影響

      共培養(yǎng)EPCs顯著抑制SMCs的增殖。與P4組相比,P4YE組與P4AE組[3H]-TdR摻入量均顯著降低(P<0.05),P4YE組與P4AE組的摻入量也有顯著差別(P<0.05),見圖5。

      Figure 5.The effect of donor age and co-culture EPCs on the proliferation of SMCs.Mean±SD.n=6.#P<0.05,##P<0.01 vs P4 group;▽P<0.05 vs P4YE group.圖5 共培養(yǎng)EPCs對SMCs的增殖能力的影響

      4 共培養(yǎng)EPCs對SMCs的遷移的影響

      供體年齡對共培養(yǎng)融合生長EPCs條件下SMCs遷移能力的影響見圖6。細(xì)胞培養(yǎng)12 h后,與P4組相比,P4YE余留面積顯著增加(P<0.01),P4AE組也比P4組顯著增加(P<0.05),但顯著低于P4YE組(P<0.05),表明年輕大鼠來源的融合生長EPCs可以顯著抑制SMCs遷移,EPCs供體衰老削弱融合生長EPCs對SMCs遷移的抑制能力。

      討 論

      EPCs也稱內(nèi)皮前體細(xì)胞,可分化為成熟的ECs,參與損傷血管再內(nèi)皮化及血管重建,且抑制新生內(nèi)膜增生[2-3]。骨髓是EPCs主要來源之一,在缺血組織血管新生及血管內(nèi)膜損傷時可動員入血,歸巢到血管損傷部位,參與損傷血管內(nèi)膜修復(fù)。盡管已有大量關(guān)于EPCs表型特征以及臨床應(yīng)用的研究,但是迄今尚未有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法以及統(tǒng)一的定義,比較明確的是,EPCs既具有干細(xì)胞特性,又具有ECs的部分特征,可以誘導(dǎo)分化為成熟ECs。ECs具有吞噬Ac-LDL功能,同時有具有結(jié)合UEA-I特性,目前已有較多文獻(xiàn)研究以DiI-Ac-LDL以及FITC-UEA-I雙染陽性作為鑒定EPCs的重要指標(biāo)之一[11-12];在干細(xì)胞標(biāo)志方面EPCs主要表達(dá)CD34、CD133等[13-14]。本次實(shí)驗(yàn)選擇2次貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)EPCs,文獻(xiàn)報(bào)道該方法可有效減少包括成熟ECs在內(nèi)的其它類別單個核細(xì)胞影響[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示培養(yǎng)的骨髓MNCs DiI-Ac-LDL與FITC-UEA-I雙染陽性,流式細(xì)胞分析也表明培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)VEGFR2、CD34和CD133,證實(shí)此次實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的骨髓MNCs具有EPCs生物學(xué)特征。此外,在EPCs增殖速度以及表面標(biāo)志表達(dá)方面,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)不同年齡個體來源EPCs活性具有年齡相關(guān)性特點(diǎn)。

      Figure 6.The effect of donor age and co-culture EPCs on the migration ability of SMCs.The cell migration ability was examined by scratch wound healing assay under a microscope.Mean ± SD.n=5.Scale bar=100 μm.#P<0.05,##P<0.01 vs P4 group;▽P<0.05 vs P4YE group.圖6 共培養(yǎng)EPC對SMCs的遷移能力的影響

      EPCs歸巢到血管損傷部位修復(fù)損傷血管過程中,主要受到來自血管損傷邊緣的ECs、再生內(nèi)皮或損傷處暴露的SMCs的調(diào)節(jié)作用。EPCs與SMCs自身均可以表達(dá)多種蛋白或者分泌細(xì)胞因子,相互影響這兩種細(xì)胞的生物學(xué)行為,可能極大地影響其修復(fù)損傷血管進(jìn)程,已有研究發(fā)現(xiàn)ECs調(diào)節(jié)了SMCs的增生和遷移[15]。盡管有大量文獻(xiàn)報(bào)道EPCs促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮再生[1-2]以及抑制新生內(nèi)膜增生[2-4],然而迄今未見有關(guān)于EPCs與SMCs間相互影響的文獻(xiàn)報(bào)道。文獻(xiàn)研究以及本次實(shí)驗(yàn)均表明EPCs生物學(xué)活性具有年齡相關(guān)性特點(diǎn),年輕大鼠來源EPCs較老齡大鼠來源者具有更好的增殖、遷移和分化能力[5-6,12],因此 EPCs 供體年齡也可能調(diào)節(jié) EPCs 與SMCs間相互作用,進(jìn)而影響EPCs修復(fù)損傷血管內(nèi)膜進(jìn)程。

      血管在胚胎發(fā)生期來自中胚層,在以后的發(fā)育過程中,逐漸分化為不同的細(xì)胞群,并獲得具有成年特征的分化表型。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同,VSMCs可分為收縮型(分化型)和合成型(未分化型或去分化型)2種表型,SMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)換是其開始增生的先決條件[16]。正常時血管SMCs為收縮型,各種因素導(dǎo)致血管損傷后,暴露的血管SMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變,隨即開始增生、遷移形成新生內(nèi)膜。α-SM-actin是收縮型血管SMCs主要標(biāo)志之一[10],在合成型中表達(dá)甚微[16],而 osteopontin 是合成型SMCs的重要標(biāo)志,在收縮型中幾乎不表達(dá)[9]。在離體培養(yǎng)SMCs過程中,隨著細(xì)胞傳代,SMCs表型也迅速由主要是收縮型向合成型轉(zhuǎn)變[17]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在P3與P4 SMCs中,α-SM-actin表達(dá)顯著下調(diào),而osteopontin表達(dá)則顯著上調(diào)。共培養(yǎng)研究結(jié)果顯示融合生長狀態(tài)的EPCs可以顯著抑制傳代培養(yǎng)SMCs的α-SM-actin表達(dá)下調(diào),同時也阻抑osteopontin表達(dá)上調(diào),表明融合生長狀態(tài)的EPCs可以延緩SMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變,提示在損傷血管過程中EPCs抑制損傷血管SMCs表型轉(zhuǎn)換可能是重要調(diào)節(jié)機(jī)制之一。實(shí)驗(yàn)也觀察到老齡個體來源EPCs延緩SMCs表型轉(zhuǎn)換的能力較年輕個體來源EPCs顯著減弱,進(jìn)一步說明年輕個體來源EPCs較老齡個體來源者有更好的修復(fù)損傷血管能力。有關(guān)EPCs延遲SMCs表型轉(zhuǎn)換文獻(xiàn)研究極其少見,機(jī)制尚不明確。新近研究報(bào)道內(nèi)皮Jagged1表達(dá)在血管損傷后新生內(nèi)膜SMCs增生調(diào)控中有重要作用,Jagged1在老齡個體血管ECs較年輕個體來源ECs表達(dá)顯著減弱,ECs過表達(dá)Jagged1可顯著抑制SMCs過度增生,下調(diào)ECs Jagged1表達(dá)促進(jìn)血小板源性生長因子誘導(dǎo)的SMCs增殖和遷移[18]。我們在前期實(shí)驗(yàn)中也觀察到Jagged1也表達(dá)于EPCs,并且發(fā)現(xiàn)Jagged1在年輕個體來源EPCs表達(dá)較老齡個體顯著增強(qiáng),EPCs抑制SMCs表型轉(zhuǎn)換過程中是否通過Jagged1相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)揮作用尚需深入研究。由于血管SMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)換是其開始增生和遷移的先決條件,SMCs表型轉(zhuǎn)變從一側(cè)面反映了其增殖和遷移能力的變化,共培養(yǎng)EPCs顯著抑制SMCs增殖和遷移能力,老齡個體來源 EPCs抑制SMCs增殖和遷移能力較年輕個體來源EPCs顯著減弱,提示供體年齡在融合生長狀態(tài)EPCs抑制血管SMCs表型轉(zhuǎn)換及增殖和遷移中有重要調(diào)節(jié)作用。

      細(xì)胞間相互調(diào)節(jié)是一極復(fù)雜的病理生理活動[19-20],細(xì)胞生長狀態(tài)與其本身具有的調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道ECs不同生長狀態(tài)對SMCs具有不同的調(diào)節(jié)作用,融合生長狀態(tài)ECs促進(jìn)SMCs表達(dá)α-SM-actin,而對數(shù)生長期 ECs 則抑制其表達(dá)[21]。此外ECs和SMCs間相互作用不僅調(diào)節(jié)了SMCs生物學(xué)特性,而且對ECs本身也具有調(diào)節(jié)作用。新近研究報(bào)道ECs與SMCs之間通過連接蛋白Cx43和Cx47進(jìn)行相互調(diào)節(jié),并且證實(shí)ECs與SMCs之間相互作用調(diào)節(jié)了ECs的表型[22]。本次研究結(jié)果揭示EPCs調(diào)節(jié)SMCs表型轉(zhuǎn)換和增殖遷移具有年齡相關(guān)性,為EPCs臨床應(yīng)用提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù),然而本次實(shí)驗(yàn)共培養(yǎng)體系中使用融合生長狀態(tài)EPCs,對于其它生長狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、接觸方式等對SMCs有何不同調(diào)節(jié)作用尚未明確,EPCs本身具有干、祖細(xì)胞特性,SMCs表型變化、生長狀態(tài)也極可能影響EPCs分化及功能,反過來又可能影響EPCs對SMCs的調(diào)節(jié),因此對于闡明EPCs與SMCs間相互調(diào)節(jié)作用及詳細(xì)機(jī)制,尚需大量深入的研究。

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