余 婷，林天興,2，龔明福,2

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魔芋內(nèi)生細(xì)菌抗軟腐病菌株篩選

余 婷1，林天興1,2，*龔明福1,2

（1. 樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川，樂山 614000；2. 峨眉山生物多樣性保護(hù)與利用研究所，四川，樂山 614000）

通過組織分離法從魔芋塊莖中分離得到內(nèi)生細(xì)菌，用牛津杯法皿內(nèi)測(cè)試內(nèi)生細(xì)菌對(duì)魔芋軟腐病菌的拮抗作用，以篩選拮抗軟腐病菌能力強(qiáng)的菌株。結(jié)果顯示從魔芋塊莖中分離得到35株內(nèi)生細(xì)菌，35株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)魔芋軟腐病菌均有不同程度的拮抗活性，不同菌株間拮抗活性存在顯著差異。初篩中，對(duì)軟腐病菌相對(duì)抑制率（RIR）達(dá)到50%以上的內(nèi)生細(xì)菌有17株，100%的有11株。復(fù)篩中RIR為100%的內(nèi)生細(xì)菌有8株，其中7株胞外產(chǎn)物的RIR超過了150%。

魔芋；內(nèi)生細(xì)菌；軟腐??；胡蘿卜軟腐歐文氏菌

魔芋（）在中國廣泛栽培，其球莖中葡甘聚糖含量非常豐富，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工和農(nóng)業(yè)等行業(yè)中。魔芋軟腐病是魔芋的主要病害，已經(jīng)嚴(yán)重影響到魔芋的生產(chǎn)，它是魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展的嚴(yán)重障礙。該病是由胡蘿卜軟腐歐文氏菌（subsp，ECC）引起的細(xì)菌性病害[1]。

近年來內(nèi)生細(xì)菌作為植物病害防治和促進(jìn)植物生長的新資源，它被越來越多的專家和學(xué)者所關(guān)注[2-3]。生活在魔芋組織中的內(nèi)生細(xì)菌具有抗魔芋軟腐病病菌的潛力，用植物內(nèi)生細(xì)菌作為生物防治劑不僅能很好地適應(yīng)植株體內(nèi)的生活環(huán)境，并對(duì)維管束病害能夠進(jìn)行有效的抑制[4]，同時(shí)還不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。目前已有許多利用內(nèi)生細(xì)菌或其代謝物防治魔芋軟腐病的研究報(bào)道[5-8]。

本課題組近年來分別從四川夾江縣、峨眉山和沐川縣魔芋塊莖中分離得到了35株內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)其拮抗魔芋軟腐病菌的能力進(jìn)行了測(cè)定。研究結(jié)果可以為高效抗魔芋軟腐病菌內(nèi)生菌菌株的篩選及魔芋軟腐病的生物防治提供技術(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL，pH7.2~7.4，121 ℃滅菌30 min。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液（NB）：NA培養(yǎng)基中不加瓊脂。

1.2 魔芋內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

從四川夾江縣、峨眉山和沐川縣魔芋種植區(qū)采集魔芋塊莖，進(jìn)行表面消毒后將塊莖打碎，打碎的組織液以倍比稀釋的方法稀釋至10-3濃度，取不同稀釋度的組織液涂布接種于NA平板上，每平板接種100 μL，每種濃度接種3個(gè)平板，28 ℃培養(yǎng)1 ~2 d。將生長出的內(nèi)生細(xì)菌單個(gè)菌落按照形態(tài)、顏色、透明度、大小等指標(biāo)挑選并接種于NA平板上進(jìn)一步純化得到純菌落后接種于NA斜面，28 ℃培養(yǎng)24 h后置4℃保藏備用。

1.3 拮抗性內(nèi)生細(xì)菌的篩選

初篩：在NA 板涂布接種0.1 mL 軟腐病菌培養(yǎng)液（109~1010cfu.mL-1）。取四個(gè)規(guī)格相同的滅菌牛津杯（內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm）均勻插入NA板之間并保證牛津杯不能接觸到NA平板的底部。分裝100 μL測(cè)試供試內(nèi)生菌菌液于三個(gè)牛津杯中。最后一個(gè)牛津杯中裝入100 μL的滅菌的菌液作為對(duì)照組，每處理重復(fù)3次， 28 ℃下培養(yǎng)48 h。48 h后測(cè)量抑菌圈的大小。內(nèi)生細(xì)菌對(duì)病原細(xì)菌的拮抗活性用相對(duì)抑制率( relative inhibition ratio，RIR )表示。RIR用以下公式計(jì)算：RIR (%) = (DT-DCK)/ DCK×100%。其中DT表示內(nèi)生細(xì)菌抑菌圈的直徑，DCK表示牛津杯的外直徑。RIR超過50%則被認(rèn)為有顯著的拮抗活性。

復(fù)篩：對(duì)初篩RIR值達(dá)50%以上的內(nèi)生細(xì)菌菌株按牛津法皿內(nèi)拮抗法再重復(fù)篩選1次，在復(fù)篩中RIR超過100%則被認(rèn)為有顯著的拮抗活性。

1.4 胞外產(chǎn)物的拮抗活性測(cè)定

將復(fù)篩中RIR超過100%的試驗(yàn)菌株按107CFU/mL濃度接種到100 mL NB培養(yǎng)液中，160 rpm 28 ℃振蕩培養(yǎng)2 d。在12 000 rpm離心10 min，過濾上清液（0.22 μm孔徑膜），獲得的過濾液即為主要胞外產(chǎn)物。將0.1 mL的胞外產(chǎn)物滴加于瓊脂培養(yǎng)基的表面以測(cè)試其有無抗菌活性。胞外產(chǎn)物的抗菌活性測(cè)定方法與初篩中描述的牛津杯法相同。

2 結(jié)果及分析

2.1 魔芋內(nèi)生細(xì)菌的分離

從四川夾江縣、峨眉山和沐川縣魔芋塊莖中分離得到35株內(nèi)生細(xì)菌，分別編號(hào)為AKEB01~AKEB35，其中AKEB01~AKEB10分離于夾江縣，AKEB11~AKEB25分離于峨眉山，AKEB26~AKEB35分離于沐川縣。

2.2 拮抗性內(nèi)生細(xì)菌的初篩

從魔芋中分離得到的35株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)魔芋軟腐病病原細(xì)菌均存在一定的拮抗活性（見表1），不同菌株的抗菌活性具明顯差異。初篩中RIR達(dá)50%以上內(nèi)生細(xì)菌有17株，其中有11 株的RIR為100%，包括AKEB06、AKEB11、AKEB16、AKEB20、AKEB21、AKEB23、AKEB26、 AKEB28、AKEB32、AKEB33 和 AKEB35等菌株。RIR在50%~100%范圍的菌株有6株，分別為AKEB01、AKEB13、AKEB14、AKEB19、AKEB 25和AKEB31。具顯著拮抗活性的菌株比率為48.57%。

表1 魔芋內(nèi)生細(xì)菌抗軟腐病菌株初篩相對(duì)抑制率

2.2 拮抗性內(nèi)生細(xì)菌的復(fù)篩

初篩中RIR 達(dá)50%以上的17株內(nèi)生細(xì)菌菌株復(fù)篩時(shí)拮抗活性仍然較高(見表2)，不同菌株的拮抗活性有顯著差異。其中有8株的RIR達(dá)100%，包括AKEB06、AKEB11、AKEB16、AKEB20、AKEB23、AKEB28、AKEB32和AKEB35。

表2 拮抗性內(nèi)生細(xì)菌復(fù)篩相對(duì)抑制率

2.3 胞外產(chǎn)物的拮抗活性

8株復(fù)篩RIR達(dá)100%的內(nèi)生細(xì)菌菌株的主要胞外產(chǎn)物拮抗活性相對(duì)較高 (見表3)。除AKEB11菌株外的所有實(shí)驗(yàn)菌株胞外產(chǎn)物的RIR均達(dá)150%以上。

3 小結(jié)與討論

本研究獲得的35株內(nèi)生細(xì)菌，均是從健康魔芋球莖中分離得到的。結(jié)果顯示所有從魔芋中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌，它對(duì)魔芋軟腐病病菌都具有不同程度的拮抗作用。在初篩中有17株菌株的RIR達(dá)50%以上，在復(fù)篩中RIR達(dá)100%以上的菌株有8株，其中7株胞外產(chǎn)物的RIR達(dá)150%以上。

目前，拮抗細(xì)菌性病原的物質(zhì)大多基于體外抗菌法從草藥及其提取物中篩選獲得[8-10]。本研究從魔芋中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌菌株表現(xiàn)出較好的拮抗活性，因此，從具有軟腐病抗性的內(nèi)生細(xì)菌菌株中篩選出對(duì)軟腐病病菌具拮抗性的內(nèi)生細(xì)菌有很好的發(fā)展前景。

表3 拮抗性內(nèi)生細(xì)菌胞外產(chǎn)物相對(duì)抑制率

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SCREENING OF ENDOPHYTIC BACTERIA ISOLATED FROMAGAINST SOFT ROT DISEASE

*YU Ting1, LIN Tian-xing1,2, *GONG Ming-fu1,2

(1. College of Life Sciences, Leshan Normal University, Leshan, Sichuan 614000, China; 2. Research Institute Protection ＆ Utilization of Biodiversiyt in Mount Emei, Leshan, Sichuan 614000, China)

Endophytic bacteria lived inhave the potential of antagonistic bacterial pathogen activity against tosoft rot pathogensubsp( ECC). The paper was to study and analyze all strains of 35 endophytic bacteria isolated fromwith strong antagonistic effect against to ECC. The antagonistic bacterial pathogen activity of different bacterial strains were significantly different. The number of endophytic bacteria with relative inhibition ratio ( RIR ) more than 50 % in the first screening was 17, in which there was 11 strains with RIR more than 100 % in the first screening, 8 strains with RIR more than 100 % in the second screening. RIR of the crude extracellular product of seven strains was more than 150%.

; Endophytic bacteria; Soft rot disease;subsp

1674-8085(2015)06-0052-04

Q939.9

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.06.011

2015-06-17；修改日期：2015-08-17

四川省教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目(15ZA0278，15TD0026)；樂山師范學(xué)院科研計(jì)劃項(xiàng)目(Z1160)

余 婷(1995-)，女，四川成都人，樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫專業(yè)本科生 (E-mail:962440424@qq.com);

林天興(1972-)，男，四川沐川人，副教授，碩士，主要從事微生物資源研究(E-mail:182476903@qq.com);

*龔明福(1970-)，男，四川鄰水人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事微生物資源研究(E-mail:gongmingfu98@163.com).