馬紅葉，鄭仁朝，趙川東，鄭裕國

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所 教育部生物轉(zhuǎn)化與生物凈化工程研究中心，浙江 杭州 310032）

重組大腸桿菌產(chǎn)疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶分批補料發(fā)酵工藝

馬紅葉，鄭仁朝，趙川東，鄭裕國

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所 教育部生物轉(zhuǎn)化與生物凈化工程研究中心，浙江 杭州 310032）

為了獲得低成本的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶（TLL），在5 L發(fā)酵罐發(fā)酵中對工程菌E.coli BL21（DE3）/ pET28b-TLL的分批補料發(fā)酵工藝進行研究。結(jié)果表明：以葡萄糖為碳源的補料培養(yǎng)基，采用溶氧（DO）反饋補料策略進行補料，當(dāng)OD600=60時降溫至28℃，分2次加入終質(zhì)量濃度為30g/L乳糖進行誘導(dǎo)表達。優(yōu)化后TLL的表達量提高到798.5 U/L，是優(yōu)化前的2.4倍。本研究為規(guī)?；l(fā)酵重組菌生產(chǎn)TLL奠定了基礎(chǔ)。

疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶；分批補料；發(fā)酵；大腸桿菌

疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶（Thermomyces lanuginosus lipase，TLL）是一種嗜堿性、熱穩(wěn)定脂肪酶，其最適反應(yīng)溫度為60℃［1］。TLL與其他嗜熱真菌脂肪酶相比，具有更高的催化效率［2］。目前，TLL已被Novozymes公司制成商品化脂肪酶Lipolase?和Lipozyme TL IM?，廣泛應(yīng)用于食品、洗滌、生物柴油和精細(xì)化學(xué)品等領(lǐng)域［2-3］。近年來，隨著綠色制藥的興起，TLL在手性醫(yī)藥中間體制備中的應(yīng)用越來越多，如利用Lipolase?選擇性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯（CNDE）合成（3S）-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，用于普瑞巴林的生產(chǎn)［4］。

由于TLL商品化酶價格昂貴，一定程度上限制了其大規(guī)模應(yīng)用。通過前期研究，筆者所在課題組成功實現(xiàn)了TLL在大腸桿菌中的活性表達，并優(yōu)化了其在搖瓶中的表達條件［5］。分批補料技術(shù)通過控制培養(yǎng)過程基質(zhì)濃度，解除細(xì)胞生長底物抑制，實現(xiàn)工程菌的高密度生長與目標(biāo)酶的高表達，已成為微生物發(fā)酵工藝研究和工業(yè)化應(yīng)用的重要策略之一［6-7］。

本研究中，筆者采用分批補料培養(yǎng)技術(shù)，在5 L發(fā)酵罐中對基因工程菌 E.coli BL21（DE3）/ pET28b-TLL分批補料培養(yǎng)工藝進行研究，優(yōu)化培養(yǎng)控制條件，以期實現(xiàn) TLL的高表達，用于水解CNDE制備普瑞巴林手性中間體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

從Thermomyces lanuginosus ZJB09222中克隆獲得的TLL基因，插入pET28b的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點之間，構(gòu)建基因工程菌 E.coli BL21（DE3）/ pET28b-TLL［5］。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10、瓊脂粉20。

種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10，pH 7.0。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 7、酵母粉 8、甘油3、K2HPO42、MgSO4·7H2O 2、NaCl 1；pH 7.0。

補料培養(yǎng)基A（g/L）：甘油100、酵母粉25、蛋白胨25、MgSO4·7H2O 10、KH2PO47、NaCl 5。

補料培養(yǎng)基B（g/L）：甘油100、酵母粉50、蛋白胨5、MgSO4·7H2O 10、KH2PO47、NaCl 5。

補料培養(yǎng)基 C（g/L）：葡萄糖 500、酵母粉50、蛋白胨 75、MgSO4·7H2O 7、檸檬酸 3、KH2PO47、（NH4）2SO45、Na2HPO4·12H2O 3、MgCl25、NH4Cl 0.1。

1.1.3 儀器與設(shè)備

GC-14C型氣相色譜儀，島津蘇州儀器有限公司；DU-800型紫外分光光度計，Beckman Coulter有限公司；RALFplus-5L生物反應(yīng)器，上海寶興生物器材有限公司；SBA40E型生物傳感器分析儀，山東省生物科學(xué)研究所。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子液培養(yǎng)

從活化斜面挑取菌落接種至LB培養(yǎng)基（含終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的卡那霉素）中，37℃、150r/min振蕩培養(yǎng)8 h，作為種子液。

1.2.2 初始發(fā)酵培養(yǎng)條件

種子液按2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接入裝有2.5 L基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，在37℃、攪拌速率500r/min、通氣量2 L/min條件下發(fā)酵。當(dāng)OD600達到一定值時，降溫至28℃，加入乳糖進行誘導(dǎo)。

1.3 分析方法

1.3.1 菌體干質(zhì)量和葡萄糖含量測定

發(fā)酵過程中通過測定 600 nm下的吸收值OD600，并根據(jù)菌體生物量（DCW）（y）與OD600（x）線性回歸方程為y=0.061 6+0.036 6x（R2=0.997 1）得到菌體生物量；發(fā)酵液中葡萄糖含量使用生物傳感器分析儀測定。

1.3.2 酶活測定

以CNDE為底物，檢測水解產(chǎn)物2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的生成量測定大腸桿菌全細(xì)胞的TLL活力。將10mL發(fā)酵液離心，得到菌體，轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)化瓶，用10mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 8.0）懸浮細(xì)胞，加入150 mmol/L醋酸鈣解除產(chǎn)物抑制［4］。置于 40℃ 水浴搖床，加入 100 mmol/L CNDE，150r/min，反應(yīng)60min后取樣。樣品經(jīng)乙酸乙酯萃取，有機相用于氣相色譜分析，色譜柱為Astec CHIRALDEX G-TA（30 m×0.25mm，0.25 μm），柱溫為135℃，檢測器和進樣口溫度均為220℃［8］。

酶活（U）單位定義：在pH 8.0，40℃條件下，每分鐘水解CNDE產(chǎn)生1 μmol（3S）-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸所需的酶量定義為1個酶活單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 補料培養(yǎng)基對菌體生長和脂肪酶表達的影響

分別以葡萄糖補料培養(yǎng)基和甘油補料培養(yǎng)基進行補料分批發(fā)酵，考察不同補料培養(yǎng)基對工程菌生長和脂肪酶表達的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知：補料培養(yǎng)基A和B均以甘油為碳源，但氮源含量不同，菌體生長速度較慢，發(fā)酵后期出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象，菌體量較低，分別為16.5和18.4g/L。補料培養(yǎng)基C以葡萄糖作為碳源，發(fā)酵前期菌體生長速度較快，整個發(fā)酵過程菌體持續(xù)生長，未出現(xiàn)菌體自溶，菌體密度比以甘油為碳源時高，且脂肪酶比酶活（496.3 U/L）也高于以甘油做碳源的補料培養(yǎng)基A（339.0 U/L）和B（402.1 U/L）。其原因可能是菌體代謝甘油效率低，無法滿足菌體生長需要，菌體量較低。此外，發(fā)酵過程中甘油殘留量高，導(dǎo)致發(fā)酵液黏度系數(shù)上升，供氧不足，菌體出現(xiàn)自溶。綜合考慮培養(yǎng)基成本和脂肪酶表達量，選擇補料培養(yǎng)基C進行流加補料。

圖1 補料培養(yǎng)基對細(xì)胞生長和脂肪酶表達的影響Fig.1 Effects of fed-batch medium on cell growth and lipase production

2.2 補料控制工藝對菌體生長和脂肪酶表達的影響

發(fā)酵過程中pH和溶解氧（DO）受菌體代謝基質(zhì)影響，當(dāng)發(fā)酵液的pH和溶解氧過高或過低時，均會抑制菌體的生長代謝和表達［9］。根據(jù)分批補料培養(yǎng)不同控制方式特點［10-11］，選擇在pH 7.2時進行pH反饋流加補料，當(dāng)發(fā)酵液pH低于7.2時，便以一定的速率及時補入補料培養(yǎng)基；溶氧反饋補料則控制DO為50%，當(dāng)DO大于50%時，流加補料培養(yǎng)基，降低攪拌轉(zhuǎn)速，維持DO的穩(wěn)定。考察pH反饋流加和溶氧反饋流加2種補料策略對菌體生長及酶表達的影響，結(jié)果分別見圖2和圖3。

由圖2和圖3可知：pH反饋補料（圖2）和溶氧反饋補料（圖3）均維持葡萄糖濃度在較低水平，減弱葡萄糖效應(yīng)，實現(xiàn)脂肪酶的高效表達。溶氧反饋補料時，菌體量和比酶活分別為26.9g/L和501.7 U/L，均優(yōu)于pH反饋補料時的菌體量（23.1g/L）和比酶活（435.3 U/L）。因此選擇控制溶氧進行分批補料培養(yǎng)。

圖2 pH反饋補料對細(xì)胞生長和脂肪酶表達的影響Fig.2 Effects of pH feed-back controlled substrate feeding on cell growth and lipase production

圖3 溶氧反饋補料對細(xì)胞生長和脂肪酶表達的影響Fig.3 Effects of dissolved oxygen feed-back controlled substrate feeding on cell growth and lipase production

2.3 誘導(dǎo)時機對菌體生長和脂肪酶表達的影響

前期研究表明，當(dāng)E.coli BL21（DE3）/pET28b-TLL的OD600大于70時進行誘導(dǎo)，細(xì)胞生長速率和酶活較低，在乳糖誘導(dǎo)終質(zhì)量濃度為15g/L條件下，對誘導(dǎo)時機（OD600分別為20、40和60）進行優(yōu)化，結(jié)果見圖4。圖4可知：菌體生物量和體積酶活均隨誘導(dǎo)時菌體濃度的增加而增加。當(dāng)選擇在OD600=20誘導(dǎo)時，所得到的菌體生物量和比酶活最低，分別僅為25.8g/L和496.5 U/L；OD600=60誘導(dǎo)時，菌體生物量（31.6g/L）和比酶活（566.9 U/L）均達最大值。綜合菌體生物量和脂肪酶表達量，選擇在菌體密度OD600=60時誘導(dǎo)。

2.4 誘導(dǎo)劑濃度對菌體生長和脂肪酶表達的影響

在重組菌發(fā)酵過程中，誘導(dǎo)劑濃度過高或過低均不利于宿主細(xì)胞生長和目的蛋白表達。一定范圍內(nèi)，目的蛋白表達與誘導(dǎo)劑濃度成正比。誘導(dǎo)劑濃度對工程菌生長的影響見圖5。由圖5可知：選擇乳糖質(zhì)量濃度10和20g/L進行誘導(dǎo)時，誘導(dǎo)劑濃度不足，不能充分誘導(dǎo)蛋白表達，發(fā)酵終期，比酶活分別為571.3 U/L和645.7 U/L；當(dāng)誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度為30g/L時，比酶活可達726.3 U/L，繼續(xù)提高乳糖誘導(dǎo)質(zhì)量濃度至40g/L時，誘導(dǎo)劑濃度過大抑制菌體生長，目的蛋白表達降低，比酶活僅為652.1 U/L。因此，選擇乳糖質(zhì)量濃度為30g/L進行誘導(dǎo)。

圖4 誘導(dǎo)時機對菌體生長和脂肪酶表達的影響Fig.4 Effects of induction time on cell growth and lipase production

圖5 誘導(dǎo)劑濃度對細(xì)胞生長和脂肪酶表達的影響Fig.5 Effects of induction concentration on cell growth and lipase production

2.5 誘導(dǎo)方式對工程菌生長和脂肪酶表達的影響

為了獲得較好的誘導(dǎo)效果，提高重組菌的產(chǎn)酶效率，考察乳糖添加次數(shù)對工程菌生長和脂肪酶表達的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知：一次性加入乳糖誘導(dǎo)時，造成誘導(dǎo)強度過大，對宿主菌造成代謝負(fù)擔(dān)，發(fā)酵結(jié)束時OD600為103.1，比酶活僅為721.5 U/L。采用分3次加入乳糖的誘導(dǎo)效果更低（OD60097.7，比酶活589.9 U/L），可能是分次加入時乳糖誘導(dǎo)強度不夠，影響了目的基因的表達。而分2次加入誘導(dǎo)劑更有利菌體生長和脂肪酶的表達，OD600為106.2，比酶活達到792.4 U/L。

圖6 誘導(dǎo)方式對細(xì)胞生長和脂肪酶表達的影響Fig.6 Effects of induction methods on cell growth and lipase production

圖7 工程菌溶氧反饋分批補料發(fā)酵過程Fig.7 Fermentation of genetic engineering bacteria with DO feed-back controlled substrate feeding

2.6 優(yōu)化后的分批補料發(fā)酵

通過對補料培養(yǎng)基、補料方法、誘導(dǎo)等條件進行優(yōu)化，最終確定5 L發(fā)酵罐中分批補料發(fā)酵工藝：溶氧反饋-分批補料發(fā)酵，選擇補料培養(yǎng)基C進行分批補料，當(dāng)DO高于50%時，補料泵以10mL/min速率進行補加補料培養(yǎng)基，當(dāng)DO低于50%時，停止補加。菌體生長階段溫度控制在37℃，12 h后降溫至28℃誘導(dǎo)表達，分別在12 h和18 h時加入45g乳糖，使誘導(dǎo)劑終質(zhì)量濃度為30g/L，26 h時終止發(fā)酵。發(fā)酵過程中通過流加20%氨水控制pH為7.2。圖7顯示了發(fā)酵過程中的pH、殘?zhí)牵≧SC）、DO、比酶活及OD600變化。由圖7可知：發(fā)酵終期菌體生物量為38.4g/L，比酶活為798.5 U/L，與優(yōu)化前的菌體量16.6g/L，比酶活339.0 U/L相比，優(yōu)化后的分批補料發(fā)酵工藝明顯提高了菌體量和和比酶活（2.4倍），為生物酶法制備普瑞巴林關(guān)鍵中間體奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

通過對E.coli BL21（DE3）/pET28b-TLL在5 L發(fā)酵罐中分批補料發(fā)酵工藝的優(yōu)化，最終確定溶氧反饋補料的控制工藝。選擇葡萄糖為碳源的補料培養(yǎng)基進行補料，誘導(dǎo)時機為OD600=60，2次分批加入終質(zhì)量濃度為30g/L乳糖進行誘導(dǎo)。在優(yōu)化后發(fā)酵條件進行分批補料發(fā)酵，TLL的比酶活由優(yōu)化前的339.0 U/L提高到798.5 U/L，是優(yōu)化前的2.4倍。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Optimization of fed-batch fermentation for Thermomyces lanuginosus lipase production with recombinant Eschericha coli

MA Hongye，ZHENG Renchao，ZHAO Chuandong，ZHENG Yuguo
（Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification of the Ministry of Education，Institute of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

To establish cost-effective Thermomyces lanuginosus lipase（TLL）production process，fedbatch fermentation of the recombinant Eschericha coli BL21（DE3）/pET28b-TLL was optimized in a 5-L bioreactor.The fed-batch medium with glucose as the main carbon source was fed by dissolved oxygen（DO）feedback method.The temperature was lowered down to 28℃ until the optical density at 600 nm reached about 60.And lactose was added twice at a final concentration of 30g/L to induce expression. Under the optimal culture conditions，the volumetric activity of TLL reached 798.5 U/L that was 2.4-fold higher than that before the optimization.This findings will provide basis industrial production of TLL.

Thermomyces lanuginosus lipase；fed-batch culture；fermentation；Eschericha coli

Q815

A

1672-3678（2015）02-0009-04

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.002

2014-03-13

浙江省重大科技專項重大社會發(fā)展項目（2012C03005-2）

馬紅葉（1986—），女，河南南陽人，碩士研究生，研究方向：工業(yè)生物技術(shù)；鄭裕國（聯(lián)系人），教授，E-mail：zhengyg@zjut.edu.cn