基于納米通道表面增強拉曼散射光譜分離檢測組氨酸對映體的研究

鐘桐生+尹志芳+柳悅+黃杉生

摘 要 以Al2O3納米通道膜為基體制備金納米通道，以場發(fā)射掃描電鏡、循環(huán)伏安、交流阻抗等方法對金納米通道進行表征。采用EDC-NHS的交聯(lián)反應，將殼聚糖自組裝至金納米通道孔壁上，形成表面具有手性位點選擇性的功能化納米通道膜，利用納米通道優(yōu)異的分離能力手性分離D-，L-組氨酸?？疾炝思{米通道孔徑和溶液的pH值對分離效果的影響。采用銀溶膠作為表面增強拉曼（SERS）測試的基底，增強對D-，L-組氨酸的SERS效應，提高檢測該物質的選擇性和靈敏度。分別在1000和1590 cm處測定L-組氨酸和D-組氨酸。在含200 μL組氨酸、100 μL銀溶膠和100 μL 80 mmol/L NaCl 溶液（pH=7.59）中，D-組氨酸和L-組氨酸可得到較好分離，分離度達到4.91。

關鍵詞 金納米通道； 手性分離； 表面增強拉曼光譜； 組氨酸

1 引 言

手性是生物體系的一個基本特征，很多內(nèi)源性大分子物質，如酶、載體、受體、血漿蛋白和多糖等都具有手性特征[1]。天然或半合成藥物幾乎都有手性，但產(chǎn)生不同的藥理作用和反應。手性對映體的分離測定，對研究生命科學、藥物化學以及人類健康都具有重要的意義[2～4]。氨基酸是組成蛋白質的基本單元，在人體生命活動中起著舉足輕重的作用，氨基酸多為外消旋體，D型氨基酸在生理活性和實際用途與L型有很大差別，因此D-，L-氨基酸對映體的分離是生命科學研究的基礎內(nèi)容之一，在蛋白質多肽的研究、有機化學中的不對稱合成以及醫(yī)藥、食品、衛(wèi)生等領域的研究中都具有重要意義。常用的手性對映體的分離方法有化學分離法、結晶拆分法、酶或微生物拆分法、萃取拆分法、化學傳感器和色譜等方法[5～9]。此外，膜分離法也被廣泛用于對映體的分離[10～12]。

表面增強拉曼光譜（SERS）是表征表面分子吸附行為和分子結構的有力工具， 已成為高靈敏的研究界面效應的技術之一，廣泛應用于研究吸附分子在表面的取向及吸附行為、吸附界面表面狀態(tài)，生物大分子的界面取向及構型、構象和結構分析[13，14]。SERS已成為一個強大的分析工具，當物質分子吸附到粗糙金屬上（例如Au， Ag， Cu等），在很低的濃度甚至單分子都能有SERS效應[16～19]。

納米通道已在生物醫(yī)藥、生命科學領域的分離分析研究中顯示出高度的優(yōu)越性和實用性[19～23]。但是采用納米通道的方法分離D-，L-組氨酸，且同時利用表面增強拉曼光譜測定被分離的物質鮮有報道。本研究以氧化鋁膜為基底制備金納米通道陣列，殼聚糖在EDC-NHS的交聯(lián)作用下自組裝至金納米通道孔壁上，形成表面具有手性位點選擇性的功能化納米通道膜，利用納米通道優(yōu)異的分離能力手性分離D-，L-組氨酸。采用銀溶膠作為表面增強拉曼的基底，增強對D-，L-組氨酸的SERS效應，可對D-組氨酸和L-組氨酸同時檢測。本研究為構建納米通道分離池與SERS檢測系統(tǒng)的偶聯(lián)裝置，實現(xiàn)對被分離物質的實時檢測、深入理解分離機理打下實驗基礎，體現(xiàn)了其獨特的優(yōu)越性和廣闊的應用前景。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI-760B電化學工作站（上海辰華公司）； U形連通池（自制）； 旋光儀（Autopol IV/IV， USA）； 拉曼光譜儀（RENISHAW，英國）； S4800場發(fā)射掃描電鏡（FESEM， HITACHI，日本）。

孔徑為100 nm的氧化鋁膜購自Waterman 公司； D-組氨酸、L-組氨酸（TCI）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基硫二亞胺（EDC， 98.5%）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS， 99%）殼聚糖（CS）及3-巰基丙酸（99%）由Aldrich 公司提供；其余試劑均為分析純，實驗用水為超純水（18.2 MΩ cm）。

按文獻[24]所述方法， 用檸檬酸鈉還原法制備銀溶膠。取0.0255 g AgNO3溶于150 mL超純水中，不斷攪拌，并將溶液加熱至沸騰后，取3 mL 1%檸檬酸鈉溶液逐滴緩慢加入其中。在沸騰狀態(tài)下繼續(xù)加熱溶液10 min，同時不斷攪拌，停止加熱，自然冷卻至室溫，得到呈灰色的銀溶膠。避光保存。

制備的銀溶膠以紫外可見光譜進行表征。所制備的銀溶膠的最大吸收峰在418 nm處，這是由于金屬粒子表面的等離子共振激發(fā)或帶間躍遷，金屬膠體在紫外可見區(qū)有吸收帶或吸收區(qū)。并且在最大吸收峰之后并沒有其它的峰，這說明制得的銀溶膠的納米顆粒粒徑分布均勻，沒有團聚。因此，所制備的銀溶膠適合用作SERS活性基底。

2.2 實驗方法

2.2.1 金納米通道的制備與修飾 以Al2O3納米通道膜為基體，依文獻[25]方法制備Au納米通道膜。將所制得的Au納米通道膜浸入1%巰基丙酸溶液中，6 h后用去離子水沖洗若干次，然后浸入（5∶1， V/V）EDC-NHS溶液中， 2 h后用水沖洗干凈，將活化的膜浸沒在0.4%（w/w）的殼聚糖溶液中（pH=7.4）24 h，通過EDC-NHS交聯(lián)的殼聚糖自組裝在Au納米通道膜上，用水沖洗干凈后備用。實驗均在4℃條件下進行。為簡便計，分別以Al2O3， Al2O3/Au和Al2O3/Au/CS表示Al2O3納米通道膜、沉積了金的Al2O3納米通道膜和修飾了殼聚糖的Al2O3/Au膜。

2.2.2 納米通道傳感裝置 采用文獻[25]所用的U形池作為色氨酸對映體分離裝置，以氧化鋁納米通道膜作為分離載體，將膜置于兩U形池進樣池、透過池之間，膜的有效透過面積為0.196 cm2。在U 形連通池的進樣池中加入104 mol/L D-組氨酸和10

@@ 4 mol/L L-組氨酸各4 mL， 透過池中加入4 mL水和4 mL銀膠溶液，間隔一定時間用拉曼光譜儀檢測透過池中D-組氨酸和 L-組氨酸的量，作出滲透池中物質的量隨時間的關系，所得直線斜率之比（α）定義為兩種待測物的分離度。endprint

3 結果與討論

3.1 金納米通道和修飾膜的表征

圖1為以100 nm孔徑Al2O3膜為基底的納米通道膜， 沉積不同時間得到的金納米通道膜的FESEM圖。由圖可見，隨著鍍金時間的增加，Al2O3膜的孔徑不斷減小， 表明Au納米粒子已成功沉積在了基底膜的表面及孔道內(nèi)。

交流阻抗譜和循環(huán)伏安法是考察納米通道制備過程的有效方法[24]。由Al2O3納米通道膜在0.1 mol/L K3[Fe（CN）6]溶液中的循環(huán)伏安圖（圖2）可見，金沉積時間延長，電流下降?？赡苁怯捎陔S著金沉積時間延長，納米通道的孔徑變小，電子轉移阻力增大所致。圖3為納米通道膜在0.1 mol/L K3[Fe（CN）6]溶液中的交流阻抗譜圖。由圖3可見，Al2O3納米通道膜經(jīng)過金的沉積后，由于通道孔徑變小，阻抗變大；而Al2O3/Au膜修飾了CS后，孔徑進一步減小，其阻抗也進一步增加，表明納米通道被成功修飾。

3.2 納米通道孔徑對分離效果影響

納米通道的孔徑可通過金沉積時間控制?？疾炝瞬煌鸪练e時間后得到的金納米通道膜，經(jīng)殼聚糖修飾后對手性組氨酸分離的影響（圖4）。實驗表明，金沉積時間太短，納米通道孔徑太大，D-組氨酸和 L-組氨酸均能通過納米通道，但金沉積時間太長，則通道孔徑太小，甚至使得通道被堵死，以至組氨酸不能通過通道。 在100 nm的裸氧化鋁膜上鍍金9 h后得到的納米通道膜對D-，L-組氨酸的分離效果最好。

3.3 溶液的pH值對D，L-組氨酸分離度的影響

分別將適量pH為2.0， 3.5， 5.0， 5.6， 7.6和9.0的D-， L-組氨酸溶液及等體積空白溶液加入進樣池中，每間隔1 h后檢測池D-組氨酸和L-組氨酸含量。從圖5可見在低pH或者高pH下，Al2O3/Au/CS對D-，L-組氨酸的分離度較?。?而在pH=7.59時分離度較大。即在組氨酸等電點（pH=7.59）時的分離度最大，達到α=4.5。

10 mol/L L-組氨酸以及相同濃度的D-，L-組氨酸混合物的SERS光譜。分別取200 μL組氨酸、100 μL銀溶膠和100 μL 80 mmol/L NaCl，混合均勻。從圖6d可見， 銀溶膠起到了SERS活性基底的作用，未加入活性基底時， 組氨酸無法檢出。由于D-組氨酸和L-組氨酸的空間位阻不同，與銀微粒作用不同，振動頻率不同，所以會出現(xiàn)各自的特征峰。L-組氨酸和D-組氨酸分別在1000 cm

1（圖6b）和1590 cm

（圖6c）處有各自的特征峰； 而在D-，L-組氨酸的混合溶液中， 通過SERS檢測， 可以同時看到D-組氨酸和L-組氨酸的特征峰存在（圖6a），表明SERS可以同時檢測、區(qū)分D-組氨酸和L-組氨酸。

3.5 基底團聚時間對SERS檢測的影響

銀溶膠和組氨酸混合后的靜置時間影響組氨酸的SERS信號。考察了銀溶膠、NaCl和待測物團聚時間的影響（圖7）。以制備好的銀溶膠作為基底，分別取200 μL 1×1010 mol/L組氨酸、100 μL銀溶膠和100 μL 80 mmol/L NaCl，混合均勻。結果表明， 團聚時間對分析物檢測有很大的影響。團聚時間太短， 分析物與銀溶膠未很好地吸附，導致銀溶膠沒有起到SERS增強的效果，所以沒有SERS信號，無法檢測出待測物質。實驗中，銀溶膠和組氨酸混合1 h后再進行SERS信號的檢測。

10 mol/L D-組氨酸， （d） 組氨酸溶液中未加入銀溶膠基底。

（a） 1×1010mol/L D，L-histidine，（b） 1×1010mol/L L-histidine，（c） 1×0

10mol/L D-histidine， （d） colloidal silver was not added.

團聚0.5 h， 1×1010 mol/L L-組氨酸，（b） 團聚10 min， 1×10

10 mol/L L-組氨酸。

（a） 1×10

10 mol/L L-histidine united for 0.5 h；

（b） 1×10

10 mol/L L-histidine united for 10 min.

3.6 組氨酸檢出限的考察

3.7 組氨酸對映體在Al2O3/Au/CS中的遷移

考察了D-，L-組氨酸在修飾前的納米通道內(nèi)的遷移量隨時間的變化。由圖9A可見， Al2O3/Au納米通道膜對組氨酸對映體沒有選擇性，二者在金納米通道內(nèi)的遷移速率基本上相同，所以不能將兩者分離。圖9B為D-組氨酸、L-組氨酸通過Al2O3/Au/CS納米通道膜遷移量隨時間的變化。選擇在pH為7.59的條件下對1×10

5 mol/L D-，L-組氨酸對映體進行拆分。很顯然，D-組氨酸的遷移速率明顯大于L-組氨酸，殼聚糖功能化的金納米通道對D-，L-組氨酸對映體分離度為4.91。這是由于表面具有手性位點選擇性的殼聚糖功能化的金納米通道膜對手性組氨酸具有優(yōu)異的分離能力。

圖9 1×10

5 mol/L組氨酸手性對映體過Al2O3/Au納米通道膜（A）和過Al2O3/Au/CS納米通道膜（B）的分離情況

Fig.9 Separation efficiency of histidine enantiomers through Au nanochannels membrane （A） and chitosan functionalized Au nanochannels membrane （B）

4 結 論

以氧化鋁為模板，殼聚糖功能化的金納米通道在最佳條件下對D-，L-組氨酸對映體分離度最大達到4.91。由于SERS檢測的檢出限低，SERS可以同時檢測出D-組氨酸和L-組氨酸，可望與納米通道進行偶聯(lián)，在線實時分離檢測手性組氨酸對映體，能夠大大縮短檢測時間。本研究為構建納米通道分離池與SERS檢測系統(tǒng)的偶合裝置， 對快速便捷地分離檢測手性物質提供了方法，具有潛在、獨特的優(yōu)越性和應用前景。endprint

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